$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. ייצור וטיהור של וירוס רקומביננטי הקשור לאדנו (rAAV)
הערה: ייצור וטיהור וקטורים rAAV בוצעו על ידי ליבת הווקטור הנגיפי של לובן (LVVC).
- בקצרה, Transfect subconfluent low (<50) transition adherent HEK 293T cells באמצעות פוליאתילנימין ליניארי 25kD 150 ננומטר NaCl תמיסת טרנספקציה ושלושה פלסמידים שונים ביחס של 1:1:1 בסרום בקר עוברי בינוני DMEM 2%. לאחר 24 שעות של דגירה ב 37 ° C ב 5% CO2, להחליף את המדיום עם DMEM בינוני טרי 2% סרום בקר עוברי.
הערה: הפלסמידים כוללים את המבנים עבור הסרוטיפ AAV7, פלסמיד העברת AAV המקודד את אלפא-סינוקלאין מוטנטי A53T אנושי (α-SYN) תחת שליטתו של מקדם סינפסין משופר CMVie, ופלסמיד עוזר אדנו-ויראלי pAdvDeltaF6.
- קוצרים את התווך 5 ימים לאחר טרנספקציה חולפת ומרכזים באמצעות סינון זרימה משיק.
- לטהר את חלקיקי וקטור rAAV מן התווך המרוכז באמצעות שיפוע צעד יודיקסנול.
- השתמש בטכניקות סטנדרטיות של PCR בזמן אמת לקביעת עותק גנומי (GC). בפרוטוקול זה, טיטר וקטורי של 3.0 E11 GC/ml שימש לפיתוח מודל חולדות מבוסס α-SYN עבור מחלת פרקינסון (PD).
2. הזרקה סטריאוטקטית של וקטור rAAV α-SYN בחומר השחור (SN) של החולדה (איור 1)
- נקבות חולדות וויסטאר בנות שמונה שבועות במשקל של כ-200-250 גרם במחזור אור / חושך רגיל של 12 שעות עם גישה חופשית למזון כדורי ומי ברז.
- יש לשלוח את החולדה להרדמה תוך-צפקית (כלומר המכילה תערובת של קטמין (60 מ"ג/ק"ג) ומדטומידין (0.4 מ"ג/ק"ג). לאחר שהחולדה מורדמת ואינה מגיבה בעת לחיצת הכפות השונות, יש לתת מיקרו-משדר תת עורי על גב החולדה לזיהוי נוסף באמצעות מיקרו-טרנספונדר מושתל. בדוק אם המיקרו-משדר ממוקם כראוי וניתן לקריאה על-ידי מכשיר הקריאה.
- גזרו את השיער על גבי הקרקפת. יש למרוח חומר הרדמה מקומי הן על הקרקפת והן על האוזניים. בצע את שאר ההליך הכירורגי תחת זרימה למינרית באמצעות טכניקות אספטיות.
- הניחו את החולדות במסגרת ראש סטריאוטקטית באמצעות שני מוטות אוזניים, פה ומוט אף. כסו את גוף החולדה בשמיכת נייר כדי למנוע ירידה בטמפרטורת הגוף. יש למרוח חומר סיכה עיני כדי למנוע התייבשות של העיניים.
- לחטא את הקרקפת עם יודיום 1% באיזופרופנול 70% ולבצע חתך קטן בקו האמצע של הקרקפת. מגרדים בעדינות את הקרומים על הגולגולת ושוטפים במי מלח. תן לגולגולת להתייבש במשך מספר דקות. שימו לב לתפרי הגולגולת ולשתי נקודות הייחוס: ברגמה ולמבדה.
- כדי להזריק את וקטור rAAV לתוך SN, הגדר את הקואורדינטות לכיוון ברגמה (אנטרופוסטרי: 5.3 מ"מ; בינוני: 2.0 מ"מ; ודורסו-ונטרלי: 7.2 מ"מ מחושב מהדורה).
הערה: ניתן לחשב את הקואורדינטות התלת-ממדיות עבור כל אזור עניין באמצעות אטלס סטריאוטקסי של מוח החולדה, תוך יישום ברגמה כנקודת התייחסות אנטומית.
- מלאו מזרק מיקרו-הזרקה 10 μl (30-gauge 20 mm) בווקטור rAAV והניחו אותו במכשיר הסטריאוטקסי המחובר למשאבת מיקרו-הזרקה ממונעת. שלוט בעוצמת הקול על ידי שחרור טיפה של וקטור ובטל בחומר ניקוי רב-ערכי pH 9 (למשל RBS).
- בדקו ויזואלית אם הראש מקובע ישר במסגרת הראש והעריכו את הציר שמאל-ימין. הגדר בקפידה חזותית את הקואורדינטות האנטרופוסטריוריות והבינוניות עבור ברגמה ולמבדה ומדוד את גובהן באמצעות מחט 20 מ"מ של 30 מד בזרוע הגבית של המסגרת הסטריאוטקטית.
- אפשר הפרש גובה מרבי של 0.3 מ"מ בין ברגמה ללמדא. הניחו את המחט בחזרה על ברגמה והפעילו את הקואורדינטות האנטרופוסטריוריות והבינוניות על ידי הזזת הזרוע הקדמית והבינונית של המסגרת הסטריאוטקטית.
- במקום ההזרקה, למדוד את גובה הגולגולת ולוודא כי הוא אינו שונה יותר מ 0.3 מ"מ מגובה ברגמה. לקדוח חור בגולגולת בקוטר של כ 2 מ"מ. למדוד את גובה הדורה, אשר ישמש התייחסות להחלת הקואורדינטות dorsoventral. לחלופין, החסרו עובי קבוע לגולגולת (0.9 מ"מ).
- חודרים לדורה באמצעות מחט של 26 מד וסופגים את הדם ברקמה סטרילית. המתן עד שכל הדימום ייפסק לפני שתמשיך.
- הכנס באיטיות את מזרק המיקרו-הזרקה 10 μl הטעון מראש בתמיסה וקטורית למוח לעומק שנקבע מראש (קואורדינטת דורסו-ונטרלית). המתן דקה אחת עם המחט במקומה. הזריקו 3 μl של תמיסה וקטורית (3.0 עותקי גנום E11/ml (מינון וקטורי בינוני) או 1.0 E12 GC/ml (מינון וקטורי גבוה) של rAAV2/7 α-SYN או וקטור בקרה eGFP) באמצעות משאבת מיקרו-הזרקה ממונעת עם תפוקה של 0.25 μl/min.
- לאחר ההזרקה, שמור את המחט במקומה למשך 5 דקות נוספות לפני שתסיר אותה באיטיות. תפרו את הקרקפת באמצעות פוליאסטר קלוע מצופה 3.0, חיטאו עם 1% ג'ודיום ב-70% איזופרופנול והוציאו בעדינות את בעל החיים מהמכשיר הסטריאוטקטי. תחילה שחררו את מוט האף והפה, ולאחר מכן את שני מוטות האוזניים.
- כדי להפוך את ההרדמה, הזריקו לחולדה intraperitoneally עם 0.5 מ"ג / ק"ג atipamezole ומניחים את החולדה בכלוב נקי על צלחת חימום של 38 מעלות צלזיוס עד שהיא מתעוררת. כסו את החולדה בשמיכת נייר כדי למנוע ירידה בטמפרטורת הגוף.
- לספק גישה קלה למזון ומים בשעות הראשונות. עקבו אחר החולדה בימים הראשונים. במידת הצורך, להחיל משככי כאבים.
הערה: אין צורך להסיר את התפרים מהגולגולת. לאחר 1-2 שבועות הגולגולת מתוקנת לחלוטין, והתפרים משתחררים.
