בידוד צברי חלבונים בלתי מסיסים בדטרגנט מרקמת מוח אנושית לאחר המוות

תקציר

מקור: Diner, I., et al. Enrichment of Detergent-insoducle Protein Aggregates from Human Postmortem Brain. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מסביר את תהליך הבידוד וההעשרה של צברי חלבונים בלתי מסיסים בדטרגנטים מרקמת מוח אנושית קפואה לאחר המוות. הוא מדגים שלבים מרכזיים, כולל הומוגניזציה, טיפול בחומרי ניקוי, סוניקציה ואולטרה-צנטריפוגה כדי להפריד ולטהר את האגרגטים הבלתי מסיסים. השלב האחרון כולל מסיסה של האגרגטים במאגר אוריאה לניתוח נוסף.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. הומוגניזציה ושבירה

1. בחירת רקמות
   הערה: נבחרו רקמת קליפת המוח הקדמית הקפואה לאחר המוות מבקרת בריאות (Ctl) ומקרי אלצהיימר שאושרו פתולוגית (n = 2). הערכה נוירופתולוגית לאחר המוות של התפלגות רובד העמילואיד בוצעה על פי קריטריוני הניקוד הכמותיים למחצה של הקונסורציום להקמת רישום למחלת אלצהיימר, אם כי פתולוגיה של סבך נוירופיברילרי הוערכה בהתאם למערכת ההיערכות של בראק.
   1. השג רקמת מוח קפואה לאחר המוות מבקרת בריאות (Ctl) וממקרי אלצהיימר שאושרו פתולוגית. באמצעות מיכלים של קרח יבש, מלקחיים וסכין גילוח, הבלו ~ 250 מ"ג מנות של חומר אפור מכל דגימת רקמה על סירות שקילה חד פעמיות זפתיות, תוך הקפדה על מניעת הפשרת הרקמה. רשום את המשקל של כל חתיכה כדי להיות הומוגני.
   2. בלו ~ 250 מ"ג של חומר אפור באמצעות מלקחיים ותער על ידי בדיקה חזותית כדי לאתר את הממשק בין החומר האפור החיצוני לבין החומר הלבן הפנימי. הימנעו מחומר לבן וחשוב מכך, מכל כלי דם גדולים או אזורים דמיים, קרומי המוח או מאטר ארכנואיד. שמור את הרקמה קפואה במהלך תהליך החיתוך על ידי עבודה מהירה ותכופה הנחת סירת שקילה עם רקמת המוח לתוך מיכלי פוליסטירן עם קרח יבש.
   3. רשום את המשקל המדויק של החומר האפור שהוצא מכל פיסה קפואה באמצעות איזון אנליטי. חשב את נפח חיץ המלח הנמוך (LS) הדרוש להומוגניזציה של קפיצה (5 מ"ל/גרם או 20% w/v).
   4. הכינו חיץ LS של 10 מ"ל עם קוקטייל מעכבי פרוטאז ופוספטאז 1x וצננו על קרח.
   5. מוציאים את הרקמה השקולה ואת סירת השקילה מקרח יבש וקוביות לחתיכות בגודל של בערך 2X2 מ"מ בזמן שהיא מפשירה. מעבירים לצינור הומוגנייזר 2 מ"ל מקורר מראש על קרח.
   6. הוסף 5 מ"ל/גרם (20% w/v) של חיץ מלח נמוך כקרח (LS) עם 1X פרוטאז וקוקטייל מעכבי פוספטאז.
   7. הומוגניזציה של רקמת המוח על קרח באמצעות כ -10 פעימות של מזיק פינוי גבוה A ו -15 שבץ של מזיק פינוי נמוך B.
   8. מעבירים את כל הומוגנט לצינור פוליפרופילן 2 מ"ל באמצעות פיפטה פסטר זכוכית. תייג את הצינור עם "TH" (סה"כ הומוגנט), מספר מארז הרקמה ונפח הומוגנאט. Aliquot 0.8 מ"ל לתוך צינור מסומן 1.5 מ"ל. כל עודף הומוגנט יכול להיות aliquoted באופן דומה ומאוחסן ב -80 ° C.
   9. לכל אליציטוט של 0.8 מ"ל, הוסף 100 μL כל אחד של 5 M NaCl ו- 10% (w/v) סרקוזיל לריכוזים של 0.5 M ו- 1% w/v, בהתאמה. מערבבים היטב את הצינורות על ידי היפוך ודגרים על קרח במשך 15 דקות. סמן שפופרות עם "TH-S" (סה"כ הומוגנאט-סרקוזיל) כדי לציין שההומוגנטים נמצאים במאגר סרקוזיל (טבלה 1).
   10. סוניק כל צינור במשך שלושה פולסים של 5 שניות באמפליטודה של 30% על קרח (עוצמה מקסימלית = 40%) באמצעות בדיקת microtip.
   11. קבע את ריכוזי החלבון של ההומוגנטים באמצעות שיטת הבדיקה של חומצה ביכוניצ'ונית (BCA).
       הערה: ריכוז החלבון הממוצע של TH-S homogenates מוכן ב 5 מ"ל LS לגרם של רקמה הוא 15-20 מ"ג / מ"ל. ניתן לחלק את ההומוגנטים באופן מיידי או לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
   12. לדלל הומוגנאטים TH-S ל-10 מ"ג/מ"ל באמצעות חיץ כריש קר כקרח (טבלה 1) עם 1x פרוטאז ומעכבי פוספטאז.
   13. מעבירים 5 מ"ג חלבון (0.5 מ"ל) מכל הומוגנאט TH-S לצינורות אולטרה-צנטריפוגות פוליקרבונט 500 μL ואיזון זוגי עם חיץ הכרישים. יש להעמיס צינורות לתוך רוטור ואולטרה-צנטריפוגה מקוררים מראש בטמפרטורה של 180,000 x גרם למשך 30 דקות ב-4°C. העבירו את הסופרנאטנטים מסיסי הסרקוזיל (S1) לצינורות של 1.5 מ"ל ואחסנו ב-80°C.
       הערה: (שטיפה אופציונלית) הוסף 200 μL של חיץ ארק לצינורות האולטרה-צנטריפוגות המכילות את שברי הדטרגנט-בלתי מסיסים (P1) והרחק את הכדוריות (P1) מתחתית צינורות האולטרה-צנטריפוגות באמצעות קצה פיפטה של 200 μL.
   14. סובבו בפולס קצר את הצינורות ההפוכים במשך 2-3 שניות (≤2,500 x גרם) על מיקרוצנטריפוגה כדי להעביר את הכדוריות (P1) ואת החיץ לצינורות 1.5 מ"ל שמתחת. השהה מחדש את הכדוריות הבלתי מסיסות (P1) במאגר הכריש על ידי פיפטציה למעלה ולמטה כדי להבטיח שהגלולה תשובש.
   15. איזון זוגי, וצנטריפוגה ב 180,000 x גרם למשך 30 דקות נוספות ב 4 ° C.
   16. יש להשליך את סופרנאטנט השטיפה האופציונלי (S2) ולדגור על כדורי סרקוזיל-בלתי מסיסים (P2) ב-50-75 מיקרוליטר של חיץ אוריאה (טבלה 1) עם 1x PIC (קוקטייל מעכבי פרוטאז ופוספטאז) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי להמיס את הכדור.
       הערה: יש לחמם את מאגר האוריאה לטמפרטורת החדר לפני השימוש כדי למנוע משקעים מסוג SDS. עבור יישומים רגישים לחומרי ניקוי, השמיט SDS ממאגר השתנן ושקול לשטוף את הגלולה הבלתי מסיסה (P2) במאגר מלח נמוך לפני השעיה מחדש במאגר אוריאה.
   17. העבר את הכדוריות המושעות (P2) לצינורות 0.5 מ"ל והשתמש בסוניקציה קצרה (1 שניות) של מיקרוטיפ באמפליטודה של 20% (עוצמה מרבית = 40%) כדי להמיס את הכדוריות במלואן.
   18. קבע את ריכוזי החלבונים של שברים מסיסים בסרקוזיל (S1) ובלתי מסיסים (P2) באמצעות שיטת בדיקת BCA. יש להשתמש בשברים אלה באופן מיידי או לאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.

טבלה 1: רשימת מאגרים

10% עם תמיסת סרקוזיל: 10 גרם N-lauryl-sarcosine נתרן מלח לכל 100 מ"ל של ddH2O (יש לערבב ב-RT למשך הלילה)

מאגר דל מלח (LS): 50 mM HEPES pH 7.0, 250 mM סוכרוז, 1 mM EDTA

מאגר סרקוסיל (סרק): מאגר LS + 1% (עם / V) סרקוזיל + 0.5 M NaCl

מאגר אוריאה (מאוחסן ב--20°C): 50 mM Tris-HCl pH 8.5, 8M אוריאה, 2% SDS

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קוקטייל מעכבי פרוטאז ופוספטאז, ללא EDTA (100X)	תרמו פישר	78441	קוקטייל מעכבי פרוטאז ופוספטאז
מערכת Sonic Dismembrator (אולטרסוניקטור)	פישר סיינטיפיק	FB505110	מיקרוטיפ אולטרסוניקטור
Optimax TLX Ultracentrifuge	בקמן קולטר	361545	אולטרה-צנטריפוגה בקירור
רוטור TLA120.1	בקמן קולטר	362224	רוטור אולטרה-צנטריפוגה
צינורות פוליקרבונט 500 UL (8x34 מ"מ), קיר עבה	בקמן קולטר	343776	צינורות אולטרה-צנטריפוגות עבור רוטור TLA120.1
N-Lauroylsarcosine מלח נתרן (סרקוזיל)	סיגמא אולדריץ'	L5777-50G	מחטא
1.5 מ"ל פוליפרופילן גלולה Pestle	קימבל צ'ייס	749521-1500	כלי הומוגניזציה
מנוע אלחוטי עבור Pellet Pestle	קימבל צ'ייס	749540-0000	כלי הומוגניזציה