הערכת תפקוד מוטורי במודל ניסיוני של עכבר נוירוטיס אוטואימוני

Abstract

מקור: Gonsalvez, D. G., et al., גישה פשוטה להשראת דלקת עצבים אוטואימונית ניסיונית בעכברי C57BL/6 להערכות תפקודיות ונוירופתולוגיות. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מדגים את התהליך של הערכת תפקוד מוטורי לקוי במודל עכברי באמצעות מתן רעלן שעלת וחיסון המכיל פפטידים ואדג'ובנטים המחקים מיאלין, ולאחר מכן בדיקות הליכון להערכת תפקוד מוטורי והערכת הנזק העצבי הנובע כתוצאה מהפעלה חיסונית ודה-מיאלינציה.

Protocol

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. אינדוקציה EAN (דלקת עצבית אוטואימונית ניסיונית)

הערה: EAN יכול להיגרם בהצלחה בעכברי C57BL/6 זכרים בגילאי 6-8 שבועות. פרוטוקול האינדוקציה אורך 9 ימים בסך הכל. יום 0 מתייחס ליום החיסון הראשון. לצורך פרוטוקול זה, הזריקות בוצעו בהרדמה (ראה שלב 1.1.2 להלן).

1. ביום 1-:
   1. הכינו את תמיסת רעלן השעלת (ראו טבלת חומרים) של 1.6 מיקרוגרם/מ"ל באמצעות תמיסת מלח איזוטונית-פוספט-חוצצת עכבר סטרילית 0.1 מ' (MT-PBS).
   2. הרדמה עם isoflurane:
      1. הניחו את העכבר (C57BL/6, זכר, 6-8 שבועות) בתא ההרדמה והתאימו את זרימת החמצן ל-1 ליטר/דקה.
      2. הפעל את וופורייזר איזופלורן, כוונן אותו ל -2.5% להרדמה, עקוב אחר הנשימה והמתן 2 דקות או עד שרפלקסים ראשוניים (הקרנית והגפה האחורית) יפסיקו להגיב.
   3. הסר את העכבר מתא ההרדמה ותן 250 μL של תמיסת רעלן השעלת הנ"ל באמצעות הזרקה תוך צפקית (i.p.) באמצעות מזרק 0.5 מ"ל עם מחט 30_1/2 גרם.
   4. הכינו את החיסון הניתן להזרקה לחיסון:
      1. הכינו תמיסה A באמצעות תמיסת 2 מ"ג/מ"ל של פפטיד P0180-199 (עם > 98% טוהר, רצף S-S-K-R-G-R- Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) במי מלח 0.9%.
      2. הכינו תמיסה B באמצעות תמיסה של 20 מ"ג/מ"ל של Mycobacterium tuberculosis (ראו טבלת חומרים) באדג'ובנט המלא של פרוינד (FCA, המורכב מ-15% מונואולאט מנידים + 85% שמן פרפין ו-0.5 מ"ג/מ"ל של מיקובקטריום בוטיריקומים מיובשים).
      3. כדי ליצור את החיסון הסופי להזרקה, ערבבו חלקים שווים בנפח של תמיסות A ו-B במקצף חרוזים וערבבו אותם במהירות מקסימלית למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.
         הערה: תמיסות A ו- B ניתן לשמור כמלאי ולאחסן ב 4 ° C לכל היותר של חודש אחד, אבל החיסון הסופי המשולב חייב להיות מוכן טרי ביום הזרקת העכבר.
2. ביום 0, יש לתת 50 μL של החיסון (ההכנה המתוארת בשלב 1.1.4) לעכבר באמצעות הזרקה תת עורית באמצעות מחט 23 G.
   הערה: את ההזרקה ניתן למקם בין השכמות או בין הגפה האחורית לזנב מעל הדורסום הקאודלי.
3. ביום הראשון, הכינו את תמיסת רעלן השעלת של 1.2 מיקרוגרם/מ"ל (ב-MT-PBS) והזרימו 250 מיקרוליטר לעכבר באמצעות הזרקת i.p. באמצעות מזרק 0.5 מ"ל עם מחט 301/2 גרם.
4. ביום השלישי, חזור על שלב 1.3 לעיל.
   הערה: פתרונות מלאי A ו- B ניתן להמציא ולאחסן ב 4 ° C לכל היותר של חודש אחד. עם זאת, החיסון הסופי להזרקה, המיוצר על ידי שילוב של פתרונות מלאי A ו- B, חייב להיעשות ביום ההזרקה.
5. ביום 8, יש לתת 50 μL של החיסון (ההכנה המתוארת בשלב 1.1.4) לעכבר באמצעות הזרקה תת עורית (ראה שלב 1.2 לעיל) באותו אתר הזרקה כמו בשלב 1.2 (עבור כל חיה)

2. הערכת תפקוד מוטורי

הערה: הביצועים המוטוריים מוערכים במקביל לניקוד קליני עבור אותה קבוצת בעלי חיים. יש לחבר את מנגנון הערכת התפקוד המוטורי למחשב שבו מותקנת מערכת הדמיה של פונקציית הליכה (ראה טבלת חומרים). כמו כן, מומלץ שכל העכברים שיש להעריך צריכים להיות מורגלים למשימת הריצה לפני השראת EAN. לשם כך, ריצות תרגול (2 ריצות בדיקה לכל עכבר) מבוצעות שלושה ימים לפני השראת המחלה (יום -3).

1. הפעל את מנגנון הערכת תפקוד המנוע והפעל את לחצן האור.
2. שפשף את העכבר בחוזקה ודיו את רגליו על ידי הורדתו על מיכל מלא דיו אדום תוך אחיזת זנבו.
   הערה: שלב זה נדרש עבור זן C57BL/6, אך ניתן לדלג עליו אם נעשה שימוש בזן עכבר עם צבע פרווה לבן.
3. הכניסו את העכבר לתא ההליכה וכוונו את מהירות ההליכון ל-15 ס"מ לשנייה.
4. הפעל את ההליכון ולחץ על כפתור "הקלט" כדי ללכוד את תנועת הריצה של העכבר באמצעות מערכת ההדמיה של פונקציית ההליכה (ראה טבלת חומרים).
5. השתמש בטיימר ומדוד כל ריצה במשך 36 שניות. לאחר 36 שניות, הפסק להקליט ועצור את ההליכון.
   הערה: עכברים שאינם יכולים להשלים בהצלחה את משימת הריצה עבור מרווח זה של 36 שניות נחשבים כנכשלים.
6. שמור את קובץ הווידאו בתיקיה המיועדת.
7. חזור על השלבים לעיל עבור כל עכבר שיש להעריך. בדוק את העכברים עם אותה משימת ריצה כל 3 ימים.
8. נתח את קבצי הווידאו הערוכים באמצעות תוכנה עבור פרמטרים של פונקציית הליכה (ראה טבלת חומרים).
   הערה: הפרטים כיצד לנתח פרמטרים מוטוריים שונים משתנים בין התוכנה, לכן עיין בהוראות היצרן לפני הניתוח. בהתאם למטרות הספציפיות של המחקר, רקמות בעלי חיים ניתן לקחת בכל שלב של הערכת תפקוד פוסט-מוטורי כדי לקבל ראיות היסטולוגיות של נזק אקסונלי ומיאלין באמצעות אימונוהיסטוכימיה או מיקרוסקופ אלקטרונים.

Results

טבלה 1: פרדיגמת הציון הקליני של EAN.

הציון	קריטריונים	הערות והערות על קריטריוני הערכה
0	עכבר רגיל
1	פחות תוסס או קצף	זה מוערך בתגובה לטיפול רגיל, עכברים בדרך כלל מראים לראשונה סימ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6, זכר, בן 6-8 שבועות	Australian Bioresources Cenre, WA, אוסטרליה
רעלן שעלת	List Biological Laboratories, Inc., קליפורניה, ארה"ב	#181
0.1M עכבר-איזוטוני פוספט חצויץ מלוחים (MT-PBS)			למעבדות יהיה פרוטוקול משלהן.
איזופלורן	Pharmachem, QLD, אוסטרליה		למעבדות יהיה פרוטוקול משלהן לניהול.
פפטיד P0180–199	וושי Nordisk ביוטק ושות' סגן SHG, CHN		P0180–199, רצף S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S
חום הרג את Mycobacterium tuberculosis (זן H37RA)	Difco, MI, ארצות הברית	#231141
האדג'ובנט המלא של פרוינד (FCA)	Difco, MI, ארצות הברית	#263910
16% פרפורמאלדהיד (PFA)	שירותי מיקרוסקופיית אלקטרונים	#15710	לדלל ל 4% PFA יום של איסוף רקמות.
25% גלוטראלדהיד	ProSciTech Pty Ltd, QLD, אוסטרליה	#11-30-8	לדלל ל 2.5% גלוטראלדהיד יום של קיבוע.
נתרן אזיד	Chem-Supply Pty Ltd, SA, אוסטרליה	SL189	צור 10% (w/v) מלאי ב- 0.1M MT-PBS. יש להשתמש ב-0.03% (v/v).
סוכרוז	Chem-Supply Pty Ltd, SA, אוסטרליה	SA030	יש להשתמש ב-30% (w/v).
טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) בינונית	Sakura Finetek, CA, ארה"ב (ארצות הברית)	#4583
נסיוב חמורים רגיל	Merck Millipore, MA, ארה"ב (ארצות הברית)	#S30-100	יש להשתמש כמדלל נוגדנים בריכוז של 10% (v/v) או בריכוז אחר שנקבע על ידי מעבדה עצמית.
טריטון-X 100	סיגמא אולדריץ', מישיגן, ארה"ב (ארצות הברית)	#90o2-31-1	שימוש בדילול נוגדנים בשיעור של 0.3% (v/v) או בריכוז אחר שנקבע על ידי מעבדה עצמית.
ארנב אנטי עמילואיד מבשר חלבון (APP)	Invitrogen (Life Technologies), קליפורניה, ארה"ב	S12700	משמש בשעה 1:400 או טיטראט במעבדה משלו.
ארנב נגד מגע הקשורים חלבון-1 (Caspr)	מתנת פרופ' אליאור פלס, מכון ויצמן למדע, ישראל		משמש בשעה 1:500 או טיטראט במעבדה משלו.
מתאים Alexa Fluor נוגדנים משניים מצומדים	בדיקות מולקולריות (Life Technologies), אורגון, ארה"ב	מגוון	לשימוש בשעה 1:200 או לטיטראט במעבדה משלו. בחירת הזנים בהם הועלה הנוגדן ובחירת אלקסה פלור נתונה לשיקול דעתה של כל מעבדה.
פתרון הרכבה מימי	Dako (Agilent), CA, ארה"ב (ארצות הברית)	#S3023	לכל מעבדה תהיה העדפה משלה.
ציוד
מזרק 0.5 מ"ל עם 301/2 גרם מחטים	ב.ד.	#326105
23 גר' מחטים	ב.ד.	#305143
משטח דיו אדום			כל כרית דיו אדומה או צבע מאכל אדום יכולים לשמש לסימון כפות רגליהם של בעלי החיים.
מכשיר DigiGate (כולל הליכון)	eMouse Specifics Inc. פרמינגהם, מסצ'וסטס
מערכת הדמיה DigiGate	eMouse Specifics Inc. פרמינגהם, מסצ'וסטס
סטופר			ניתן להשתמש בכל טיימר.
תוכנת DigiGait 8	eMouse Specifics Inc. פרמינגהם, מסצ'וסטס
מיקרוסקופ מנתח	זיס		ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ ניתוח מתאים.
שקופיות טעונות	Superfrost פלוס, Lomb מדעי Pty בע מ	SF41296SP
סירוסטט	לייקה		ניתן להשתמש בכל סירוסטט מתאים.
ציוד זילוח וכלי ניתוח			למעבדות יהיו פרוטוקטולי זילוח משלהן.
תא אטום ואטום			מעבדות יכולות לייצר בעצמן באמצעות מיכל פלסטיק אטום.
פאפ פן	GeneTex (ארה"ב)		עיפרון שעווה, או מתח פני השטח יכול לשמש גם כדי ליצור באר סביב החלק הרקמתי.
מיקרוסקופ קונפוקלי	Zeis LSM780		ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ קונפוקלי עם קווי לייזר מתאימים.
פיג'י/תמונה J	המכונים הלאומיים לבריאות		זמין מ- www.fiji.sc