$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. צימוד ביטוי טרנסגנים Htt בתיווך Gal4 ו-QF בדרוזופילה
- לאסוף ו / או ליצור קווי Drosophila melanogaster טרנסגניים המכילים "דרייברים" ספציפיים לרקמות Gal4 או QF, כמו גם קווים המכילים טרנסגנים Htt מסוג פראי או מוטנטי במורד הזרם של Gal4-UAS או QF-QUAS. ודא שהחלבונים המבוטאים מטרנסגנים אלה מאוחים לחלבונים פלואורסצנטיים או מסומנים באפיטופ כדי לאפשר התמיינות של תוצרי טרנסגנים מוטנטיים ופראיים מסוג Htt באותו זבוב. ראה איור 1.
הערה: אנו משתמשים בדרך כלל במקטעים של אקסון 1 של הגן האנושי Htt. עם זאת, זבובים טרנסגניים יכולים להיווצר במקום זאת כדי לבטא מקטעי Htt ארוכים יותר או גנים אחרים אם תרצה.
- תכננו את האסטרטגיה הגנטית כך שטרנסגנים מוטנטיים וטרנסגנים מסוג Htt פראי יבואו לידי ביטוי באוכלוסיות תאים מובחנות שאינן חופפות.
- אם מתרחשת חפיפה בין ביטויים, חלבוני Htt מוטנטיים ופראיים המסונתזים באותם תאים יצטברו יחד וימנעו זיהוי של אירועים דמויי פריונים. כדי להימנע מכך, השתמשו במדכאים הספציפיים Gal4 ו-QF, Gal80 ו-QS40, בהתאמה (איור 1). בחירה בדרייברים מבוקרי התפתחות של Gal4 ו/או QF יכולה לסייע בהגבלת ביטוי של Htt מוטנטי לתאים פוסט-מיטוטיים, ולבטל את האפשרות שחלוקת התא עשויה לתרום להתפשטות צבירה מתא לתא.
- באמצעות תנאי גידול סטנדרטיים, מזדווגים את הזבובים ליצירת צאצאים המבטאים Htt מוטנטי באמצעות QF (או Gal4) באוכלוסיית תאים "תורמת" ו-Htt פראי באמצעות Gal4 (או QF) באוכלוסיית תאים "מקבלת". ראו איור 1 עבור סכמה המראה שילוב גנטי אפשרי.
הערה: מנהלי ההתקנים של QF ו-Gal4 ששימשו ליצירת הנתונים שהוצגו באיורים 1-4 ובפרסום הקודם שלנו כוללים את מנהל ההתקן של קולטן הריח DA1 (ORN), Or67d-QF, ואת מנהל ההתקן הפאן-גליאלי, repo-Gal4.
- יצירת זבובי בקרה במקביל המבטאים Htt מסוג בר הן באוכלוסיות תאים המסומנות ב-QF והן ב-Gal4.
- לאסוף צאצאים של הגנוטיפ הרצוי ולהזדקן את בעלי החיים לפי הצורך.
2. מיקרו-דיסקציה וקיבוע של מוחות דרוזופילה בוגרים
הערה: הליך דיסקציה זה שונה מפרסום קודם וניתן להשתמש בו להכנת מוחות להדמיית אותות פלואורסצנטיים ישירים מאיחוי חלבונים Htt-פלואורסצנטיים.
- אספו את החומרים הבאים והניחו על קרח: מלח חוצץ פוספט המכיל 0.03% טריטון X-100 (PBS/T); צינורות מיקרוצנטריפוגות המכילות 970 μL של 4% תמיסת קיבוע פרפורמלדהיד (PFA) שהוכנה על ידי הוספת 200 μL 20% PFA ל 770 μL PBS/T; צלחת זכוכית שקופה המכילה היטב; צינור העברה חד פעמי; שני מלקחיים מנתחים (אחד מס' 3 ואחד מס' 5).
- מרדימים את הזבובים הבוגרים באמצעותCO2 ומעבירים אותם לבאר אחת של צלחת הזכוכית על קרח.
- באמצעות צינור העברה, הוסף כמות קטנה (~ 500 μL) של PBS/T קר לבאר המכילה את הזבובים ולבאר ריקה. הימנע מהצגת בועות רבות מדי, כפי שהם יכולים להפריע דיסקציה.
- הניחו את צלחת הזכוכית על משטח שטוח מתחת למיקרוסקופ מנתח והתאימו את ההגדלה עד שגוף הזבוב ימלא את שדה הראייה ויהיה בפוקוס.
- מקמו זוג מקורות אור צוואר אווז כך שהאור יאיר את שני צידי צלחת הזכוכית. יש לעגן רקמת מעבדה מקופלת מתחת לצלחת הזכוכית כדי להשליך חלקי גוף/ציפורניים במהלך הנתיחה.
- בעזרת מלקחיים מס' 3 ביד הלא דומיננטית, מעבירים זבוב בודד לתוך הבאר המכילה PBS/T. משתקים את הזבוב על ידי אחיזה בבטנו כאשר הצד הגחוני פונה כלפי מעלה.
- כדי לשמור על הזבוב שקוע לחלוטין ב-PBS/T, הסירו את ראש הזבוב עם המלקחיים מס' 5 ביד הדומיננטית. הכנס קצה אחד של מלקחיים אלה מתחת לקוטיקולה בחלל הקטן הסמוך לחוטם בצד אחד של ראש הזבוב. הדקו את האחיזה בראש על ידי צביטת המלקחיים כדי לתפוס את העין משני הצדדים.
- הסר את ראש הזבוב מגופו על ידי משיכת שני המלקחיים זה מזה. השליכו את גוף הזבוב על רקמת מעבדה הממוקמת בקרבת מקום. שמור על לחץ על המלקחיים ביד הדומיננטית כדי שראש הזבוב לא יאבד.
- מקמו קצה אחד של המלקחיים מס' 3 ביד הלא דומיננטית באותו חלל קטן מתחת לקוטיקולה בצד השני של החוטם. לאחר המיקום, צבטו את המלקחיים כדי לאחוז את העיניים באותו מיקום משני צידי הראש.
- ברגע שהאחיזה בקוטיקולה בטוחה, פרקו בעדינות את המלקחיים ב-180°. פעולה זו תפרק את הקוטיקולה של הראש מבלי לפגוע במוח. יש להשליך את שאריות הקוטיקולה על רקמת מעבדה.
- למרות שהוא אידיאלי, הקוטיקולה של הראש לא יכולה להיות מוסרת במלואה בשלב אחד. במקרה זה, להסיר את הקוטיקולה חתיכה אחר חתיכה עד המוח נחשף במלואו. היזהר לא לפגוע במוח על ידי הימנעות ממגע ישיר עם המלקחיים.
- הסר את המוח המנותח מה- PBS/T על ידי אחיזה בקנה נשימה מחובר או על ידי שאיפת המוח לרווח שבין קצות המלקחיים על ידי פעולה נימית.
הערה: הסרת קנה הנשימה היא אופציונלית, מכיוון שהיא נוטה לא לטשטש את אונות האנטנה על פני השטח הקדמיים של המוח שבו אנו בדרך כלל מדמיינים. עם זאת, אם קנה הנשימה מפריע להדמיה, להסיר אותם בזהירות כך המוח לא ניזוק על ידי מניפולציה זו.
- מעבירים את מוח הזבוב לאחד מצינורות המיקרוצנטריפוגות המכיל תמיסה מקבעת על קרח. ודא שהמוח מתנתק מהמלקחיים ושקוע בתמיסה המקבעת.
- לאחר שכל המוחות נותחו, חשוף אותם ל"תיקון קצר" על ידי הנחת הצינורות הסגורים על נוטטור למשך ~ 5 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
הערה: שלב קיבוע קצר זה מבטיח שקל יותר לטפל במוחות בשלבים הבאים ואינם נצמדים לדפנות צינור המיקרוצנטריפוגה.
- הסר את רוב הפתרון המקבע עם פיפטה P1000 והשלך אותו.
- הימנעו משאיפת מוחות מהצינור במהלך שלב זה וכל שלב שטיפה לאחר מכן. הגדר את P1000 לנפח נמוך יותר (למשל, 650 μL) והסר את הסופרנאטנט בשני שלבים. בנוסף, החזיקו את צינורות המיקרוצנטריפוגות בקו אחד עם מקור אור (למשל אורות עיליים) תוך שאיפה לדמיין את המוח טוב יותר.
- הוסף 1 מ"ל של PBS/T טרי למוח. שטפו במהירות (< דקה) בחושך, שאפו את הסופרנאטנט מהמוח והשליכו.
- יש לחזור על הכביסה עם PBS/T בחושך בטמפרטורת החדר בהתאם ללוח הזמנים הבא: 2 שטיפות מהירות (< דקה), כביסה אחת X 5 דקות, 3 X 20 דקות וכביסה של שעה אחת. הדקו את החלק העליון על צינורות מיקרוצנטריפוגות והניחו את הצינורות על נוטטור בין השטיפות.
- אם יש צורך בצביעת DAPI, החלף את השטיפה האחרונה של שעה אחת בדגירה של 1 X 30 דקות ב- DAPI של 250 ננוגרם/מ"ל מדולל ב- PBS/T, ולאחר מכן שטיפות של 2 X מהירות ו- 1 X 20 דקות.
- לאחר השטיפה האחרונה, הסירו את רוב מאגר השטיפה סופרנטנט, תוך הקפדה לא להפריע למוח, והוסיפו 30 מיקרוליטר של מגיב אנטי-דהייה מבוסס גליצרול למוח. יש לדגור בטמפרטורה של 4°C בחושך ללא תזוזה למשך שעה אחת לפחות ועד 24 שעות.
3. הרכבת מוח שלם
- הניחו שקופית מיקרוסקופ זכוכית מתחת למיקרוסקופ מנתח ותייגו אותה עם פרטים מזהים.
הערה: לחלופין, ניתן להרכיב את המוח ישירות על זכוכית כיסוי כדי לגשת לשני צידי המוח במהלך ההדמיה. פרוטוקול המתאר הליך הרכבה זה פורסם בעבר45.
- הסר את המוחות מכל צינור מיקרוצנטריפוגה באמצעות קצה צינור קהה (שהוכן באמצעות סכין גילוח כדי להסיר את התחתית ~ 1 ס"מ מקצה 1-200 מיקרוליטר) והעבר אותם למרכז המגלשה. להעביר מגיב antifade קטן ככל האפשר עם המוח.
- השתמשו במלקחיים כדי למקם את המוח בכיוון הרצוי (למשל, הגב מצביע לכיוון החלק העליון של המגלשה והמשטח הקדמי פונה כלפי מעלה לצורך הדמיה של אונת האנטנה). כשאתם מכוונים את המוחות, קחו בחשבון את נתיב האור של המיקרוסקופ שישמש לדימות שלהם.
- הסר מגיב אנטי-דהייה עודף מהשקופית באמצעות הפינה המחודדת של רקמת מעבדה מקופלת מבלי להפריע למוח. תן לשקופית לשבת ~ 5-10 דקות בחושך כדי לאפשר למוח להיצמד לשקופית.
- הקיפו את מוחות הזבובים בארבע חתיכות קטנות של זכוכית כיסוי שבורה שהונחו בכל צד של המוח כדי ליצור ריבוע שהוא ~ 19 מ"מ x 19 מ"מ. הניחו קצה אחד של זכוכית כיסוי מס' 1.5 בגודל 22 מ"מ x 22 מ"מ ממש מחוץ לאחת מחתיכות הזכוכית הקטנות האלה, והורידו בעדינות את הכיסוי מעל המוח כדי להשלים את הרכבה על הגשר.
- הוציאו לאט מגיב אנטי-דהייה טרי כדי למלא את המשטח שמתחת לכיסוי, תוך זהירות לא להפריע לכיסוי או למוח. נגבו את עודפי האנטי-דהייה באמצעות הפינה המחודדת של רקמת מעבדה מקופלת מבלי ליצור מגע ישיר עם הכיסוי.
- הוספי טיפת לק שקוף המתייבש במהירות לכל אחת מארבע פינות הכיסוי. הניחו לייבוש במשך ~ 10 דקות. לאחר מכן, אטמו את ארבעת הקצוות של הכיסוי עם לק כדי לסגור לחלוטין את המוח.
- דמיינו את המוח באופן מיידי או אחסנו בטמפרטורה של 4°C עד להכנה.
- אם אתם מדמים פלואורסצנטיות פנימית מאיחוי חלבונים Htt-פלואורסצנטיים, דמיינו את המוח תוך 24 שעות לקבלת האות הטוב ביותר.
4. הדמיה וכימות שידור דמוי פריון של אגרגטים
- דמיינו את המוחות המותקנים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד במטרה של שמן 40X או 60/63X כדי לאסוף תמונות פרוסות z דרך האזור במוח שבו מבוטא דרייברי Gal4 ו-QF שנבחרו (איור 2A, B).
- לעורר את איחוי החלבונים הפלואורסצנטיים או חלבונים בעלי תווית חיסונית באמצעות הלייזרים המתאימים (למשל, 488 ננומטר עבור GFP/YFP/FITC או 552 ננומטר עבור mCherry/Cy3). הגדר חלונות זיהוי הלוכדים אות פלואורסצנטי מרבי תוך ביטול דיבור צולב ערוצים באמצעות מערכת זיהוי ספקטרלית או מסנני פליטת פסים/מעברים ארוכים ספציפיים לכל פלואורופור.
הערה: היו קשובים בעת הדמיה של צברי חלבונים. קל לפיקסלים במרכז כל צבירה להפוך לרוויים, במיוחד בצברים גדולים יותר. נסו למזער את הרוויה בתמונה, אבל היו מודעים לסיכון של אובדן אות ממינים מצטברים קטנים יותר (איור 2B, C, D). רוויה רבה מדי תגדיל את רקע התמונה, ותקשה על זיהוי פונקטה מבודדת. בדקו קביעות הדמיה שונות למיטוב לפני צילום התמונות הסופיות בכל ערכת נתונים.
- נתחו את הנתונים על-ידי כימות פונקטה בודדת באופן ידני על-ידי מעבר דרך פרוסות z בודדות (לדוגמה, איור 2C ואיור 4A) או על-ידי עיבוד הפרוסות הקונפוקליות ב-3 ממדים (איור 3A, B).
הערה: ניתן לעשות זאת ב- Image J או בתוכנת עיבוד תמונה אחרת.
- אם הצברים מופרדים היטב ויש פלואורסצנטיות רקע מינימלית, השתמשו בתוכנת ניתוח תמונות כדי לזהות, לכמת ולנתח באופן שיטתי את הצברים כ"אובייקטים" או "משטחים" נפרדים בשחזור תלת-ממדי של המחסנית הקונפוקלית (איור 3B).
הערה: פעולות התוכנה המתוארות הן ספציפיות למכשיר ולתוכנה שבהם נעשה שימוש כאן (ראה טבלת חומרים).
- הצג באופן חזותי סדרה z קונפוקלית במצב צפייה בתלת-ממד. השתמשו באשף "ניתוח" כדי לזהות נקודות בודדות בערוץ שנבחר (לדוגמה, הערוץ האדום עבור אגרגטים HttQ91-mCherry באיור 3). התאימו את ערכי הסף והמסננים כך שייצגו במדויק את כל הצברים בגודל הטרוגני כעצמים בודדים בתמונה.
- אפשר "פיצול אובייקטים" תחת "סינון מקדים לעיבוד בינארי" כדי להפריד בין צברים קשורים זה לזה שמוזגו באופן חריג על ידי אלגוריתם התוכנה. שים לב שהמספר הכולל של אובייקטים והמדידות הקשורות אליהם מדווח תחת "מדידות"
הערה: שיטה זו לכימות אגרגטים מוטנטיים של Htt אינה מקובלת על פרוטוקול immunostaining מכיוון שמרכז צברי העמילואיד אינו חדיר לנוגדנים. כתוצאה מכך, הצברים מופיעים במיקרוסקופ כמבנים דמויי טבעת ותוכנת ניתוח תמונות אינה מסוגלת לזהות ולהבחין במדויק בין "כתמים" בודדים אלה.
- כמת צברי Htt מסוג wild על-ידי מעבר ידני דרך ערימת z וניקוד צברי Htt מסוג wild, כדי להבטיח שאף צבירה לא תקבל ניקוד כפול אם הם מופיעים ביותר מפרוסה אחת (איור 4A).
הערה: ניתן להשתמש בגישת כימות ידנית זו כאשר מספר הצברים בכל ערימה קונפוקלית הוא סביר (למשל, 20-50). זה גם שימושי כאשר תוכנה לניתוח תמונות לא יכולה להבחין בין פונקטה בודדת לבין אות הסובב אותה באותו ערוץ (למשל, האות מ-Htt מסוג בר מפוזר בתאים סמוכים) (איור 2B, C ואיור 4A). כימות אגרגטים מסוג Htt פראי יכול גם להיות מאתגר מכיוון שמבנים נורמליים רבים במוח נראים מנוקבים (למשל, תהליכים תאיים וסינפסות). לוקליזציה משותפת של אותות Htt מסוג בר ומוטנטי יכולה לשמש כקריטריון בחירה; עם זאת, ייתכן כי כמה מוטנטיים Htt "זרעים" נופלים מתחת לגבול הזיהוי של confocal. חלבון שאינו Htt שאינו מצטבר בתאים המקבלים (למשל, GFP) יכול לשמש לסימון מבני ניקוב לא קשורים במוח.
- השתמש בתוכנת ניתוח תמונה כדי לבצע אפיון נוסף של אגרגטים בודדים. לדוגמה, קבעו את התפלגות הגודל של הצברים (איור 3C), לוקליזציה באחוזים בין חלבוני Htt מוטנטיים ופראיים (איור 4A), או מדדו ישירות אינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות FRET (איור 4B).
- קבע את התפלגות הגודל של פונקטה בודדת באמצעות אלגוריתם זיהוי ספוט או משטח המזהה במדויק את כל הצברים הגלויים בערוץ מסוים. השתמש בתוכנת ניתוח התמונות כדי לבצע מדידות רלוונטיות של כתמים או משטחים, לדוגמה לקבל מידע על 'קוטר צבירה' (איור 3C), 'נפח' או 'עוצמה' מ'מדידות' באשף "ניתוח" התוכנה המתואר בשלב 4.2.1.
הערה: באיור 3C, אנו מדווחים על התפלגות הקטרים עבור כל הפונקטה HttQ91-mCherry שזוהתה בגלומרולוס DA1 יחיד.
- קבע את אחוז הלוקליזציה המשותפת בין אגרגטים HttQ25-YFP ו- HttQ91-mCherry על-ידי העברה ידנית של פרוסה אחר פרוסה דרך ערימת z קונפוקלית (השיטה המדויקת ביותר). עם זאת, יש להקפיד לא לספור אגרגטים פעמיים. כדי למנוע זאת, ספרו צברים רק בפרוסה z מסוימת אם מישור המיקוד הוא דרך מרכז הצבר (איור 4A).
- חשב יעילות FRET עבור אגרגטים המושרים HttQ25-YFP עם אות HttQ91-mCherry מקומי באמצעות שיטת ההלבנה הפוטו-לוקלית של המקבל.
- ראשית, בטל שיחות צולבות פוטנציאליות בין ערוצי YFP ו- mCherry על ידי יצירת חלונות זיהוי עבור אותות mCherry בלבד ו- YFP בלבד שאינם מייצרים אות בערוץ השני. באמצעות הגדרות אלה, צלם 'תמונת לפני' של פונקטה HttQ25-YFP בודדת והאות HttQ91-mCherry המשויך אליה (איור 4B).
- לאחר מכן, פוטו-אקונומיקה של אות mCherry על ידי התאמת הלייזר האדום (למשל, 552 ננומטר) לעוצמה של 100% וסרוק עד שהאות נעלם. חזרו להגדרות ששימשו ל'תמונת לפני', וצלמו 'תמונה אחרי' של אותה פונקטה (איור 4B).
- חשב מדידות עוצמת פלואורסצנטיות עבור כל נקב לפני ואחרי הלבנה באמצעות תוכנת ניתוח תמונה.
- חישוב יעילות FRET על ידי הפחתת פלואורסצנטיות תורם YFP הנמדדת ב'תמונה לפני' (YFPinitial) מפלואורסצנטיות תורם YFP ב'תמונה שאחרי' (YFPfinal). חלק ערך זה ב- YFPfinal והכפל ב- 100.
הערה: ניתן לחשב את יעילות FRET פיקסל אחר פיקסל או באופן כולל עבור כל צבר HttQ25-YFP (איור 4B). Acceptor photobleaching היא טכניקה שימושית במיוחד לחישוב יעילות FRET כאשר אות mCherry המשויך לכל נקב HttQ25-YFP גבוה מספיק כדי לייצר מרווה YFP ניתנת לזיהוי לאחר הלבנה mCherry.
