יצירת פציעת דקירה קורטיקלית במודל עכבר כדי לגרום לאסטרוגליוזיס תגובתי

תקציר

מקור: Allahyari, R. V. et al. הפעלת גליוזיס תגובתי in vivo על ידי פציעת דקירה במוח הקדמי. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים את הליך פגיעת הדקירה בקליפת המוח בעכברים, הכולל חשיפה לגולגולת ויצירת נגעים במוח. הוא גורם לאסטרוגליוזיס תגובתי, תגובה נוירו-פרוטקטיבית של אסטרוציטים, לחקור טראומה במערכת העצבים המרכזית, דלקת ומנגנוני תיקון.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת עכבר לניתוח

1. מוציאים את העכבר מהכלוב הביתי ושוקלים (ז).
2. הכניסו את העכבר לתא אינדוקציה איזופלוראני וכיוונו חמצן ל-2 ליטר/דקה ואת וופורייזר איזופלורן ל-5 כדי לגרום למישור כירורגי של הרדמה, כ-3-5 דקות. יש לעקוב אחר נשימה איטית והשתקה. בדוק שהעכבר מורדם לחלוטין באמצעות רפלקס צביטת הבוהן.
3. כאשר העכבר מורדם לחלוטין, מניחים אותו במסגרת סטריאוטקסית, ומאבטחים את האף בחרוט האף, המחובר עם צינורות לאיזופלורן. הכניסו את מוטות האוזניים לתעלת האוזן והדקו, כדי להבטיח שהראש יציב.
4. לגלח את הראש מאוזן לאוזן ובין העיניים אל מאחורי האוזניים.
5. לעקר את העור עם מגבונים לסירוגין של אלכוהול איזופרופיל ותמיסת יוד בטאדין, 3 פעמים כל אחד.
6. יש למרוח דמעות מלאכותיות על שתי העיניים כדי למנוע מהן להתייבש במהלך ההליך הכירורגי.

2. הליך כירורגי

1. עקוב אחר עומק ההרדמה על ידי צביטת הבוהן או הזנב. העכבר נמצא במישור הניתוחי המתאים כאשר אין תגובה והנשימה איטית ואחידה.
2. בצע חתך עור parasagittal ממש מאחורי העיניים כמעט בין האוזניים בתנועה אחת אחת מוצקה באמצעות להב אזמל מס '11. הזיזו את העור הצידה וחתכו את צד ימין עם ההמוסטט.
3. נקה את הגולגולת של הקרום שמעל באמצעות הצד העמום של אזמל מס '11 ואפליקטורים בעלי קצוות כותנה. לחלופין, נגבו את הגולגולת עם מוליך צמר גפן טבול בתמיסת מלח 0.9%. הניחו להתייבש לחלוטין.
4. באמצעות סרגל קטן, סמן את הגבול הקדמי של הקרניוטומיה ב 1 מ"מ קאודלי לתפר העטרה ואת הקצה השמאלי של הקרניוטומיה ב 1 מ"מ לרוחב לתפר הקשת (איור 1) עם סמן קבוע. לאחר מכן סמנו את הגבולות הימניים והקאודליים של הקרניוטומיה במרחק של 4 מ"מ מהתפרים הסגיטליים והעטרתיים, בהתאמה (איור 1).
5. באמצעות מקדח 0.5 מ"מ, להתחיל לעשות craniotomy על ידי קידוח איטי בעקבות מתאר סמן קבוע. הקפד לא לפרוץ את הגולגולת לחלוטין. לחץ בעדינות על החתיכה המבודדת של העצם הקודקודית עם מלקחיים מס '5, אזורי חולשה יפנו את מקומם ללחץ. כאשר העצם הדקה חלשה מספיק בכל ההיקף, פיסת העצם מוכנה להסרה.
   הערה: אם החוקר חווה קושי להסיר את העצם בחתיכה אחת, זה מצביע על כך שהעצם לא הייתה מדוללת מספיק במהלך הקידוח. שקול לקדוח את הגולגולת עוד יותר בבעלי חיים הבאים כדי להקל על הסרה קלה של חתיכת העצם.
6. באמצעות מזרק 10 מ"ל מצויד מחט 23 גרם, להחיל כמות קטנה של 0.9% מלוחים כדי להשרות את העצם המבודדת ואת האזור קדח.
7. חבר את זרוע המניפולטור לציוד הסטריאוטקסי. חבר להב אזמל מס' 11 חדש למחזיק הבדיקה כאשר הצד החד של הלהב פונה לרוסטרלי.
   הערה: למרות שהרקמות הרוסטרליות והקאודליות חוות את הקצוות החדים והקהים של הלהב, בהתאמה, הנזק המכני שנגרם על ידי הפגיעה החודרת דומה לאורך כל היקף הנגע. אנו לא רואים הבדלים ניכרים בתכונות העיקריות של גליוזה תגובתית, כולל upregulation של ביטוי GFAP או התפשטות, בין חתכים רוסטרליים וקאודלים.
8. כדי להרחיק את זרוע המניפולטור מהדרך, הרימו בזהירות את העצם המבודדת באמצעות מלקחיים זוויתיים 5/45. הכנס את קצה המלקחיים לצד העצם המבודדת והרם, תוך שימוש במינוף כדי למשוך את חתיכת העצם שנותרה מאחור בתנועה אחת מלאה.
   הערה: היזהרו לא לדקור את המוח או להפריע לדורה שמתחת לגולגולת.
9. קחו חתיכה קטנה מקצף הג'ל הספוג והנחו אותו על המוח החשוף כדי למנוע ממנו להתייבש ולספוג את כל הדם שעשוי להימצא.
10. ברגע שקצף הג'ל נמצא במקומו, הניפו את זרוע המניפולטור למקומה והתאימו את הלהב למרכז הקרניוטומיה מעל קצף הג'ל. מוציאים את קצף הג'ל ומורידים את הלהב עד שהקצה נוגע בדורה מבלי לנקב את הדורה. סמן קואורדינטות גביות/גחון באמצעות סולם ורנייר על הזרוע האנכית של הסטריאוטקסיק.
11. באמצעות זרועו של המניפולטור, לאט להוריד את הלהב בדיוק 3 מ"מ לתוך המוח. זה מושג על ידי שימוש בסימוני סולם ורנייר על זרוע המניפולטור. הניחו ללהב להישאר במקומו למשך 5-10 שניות. הזיזו את הזרוע הסטריאוטקסית עם רוסטרל חיבור להב לקאודלי שלוש פעמים, ואפשרו ללהב להגיע לגבולות הרוסטרליים והקאודליים של הקרניוטומיה לפני המעבר לקצה הנגדי.
    הערה: הדורה אינה מוסרת לפני החדרת הלהב. בניגוד לדורה של החולדה, שעוביה ~80 מיקרומטר7, דורא העכבר דק יותר במידה ניכרת (עובי של שכבות תאים ספורות בלבד) ואינו מייצר התנגדות ניכרת ללהב האזמל במהלך החדרתו. השתמש בלהב אזמל חדש עבור כל עכבר כדי להבטיח שכל בעל חיים יקבל פציעה עקבית.
12. לאט להרים את הזרוע סטריאוטקסית, להסיר את הלהב מן המוח. לאחר הסרת הלהב, הניחו מיד חתיכה נוספת של קצף ג'ל על משטח המוח כדי לספוג עודפי דם או נוזלים.
13. בינתיים, הסר את הזרוע הסטריאוטקסית והפטר את להב האזמל מספר 11. לאחר הפסקת הדימום, הסירו את קצף הג'ל.
14. סגור את הפצע על ידי תפירת העור עם תפרים שאינם נספגים, כגון אתילון או פרולן. יש להסיר תפרים 9-10 ימים לאחר הניתוח.
15. החזירו את העכבר לכלוב הביתי שלו, ואפשרו לעכבר להתאושש באיטיות על כרית חימום ולנטר כל סימן מצוקה. התאוששות מהרדמה הנגרמת על ידי איזופלואורן מתרחשת בדרך כלל תוך 2-5 דקות לאחר ההסרה מהאיזופלואורן. אין להשאיר את בעל החיים ללא השגחה עד שהוא חזר לשכיבה עצם החזה.
16. יש לתת 0.5-1 מ"ל של תמיסת רינגר מניקה באופן תת עורי כדי להבטיח הידרציה.

תוצאות

איור 1: סכמה של גולגולת העכבר המתארת את אזור הקרניוטומיה. קווים כחולים מתארים את הסימונים הראשוניים המזהים את גבולות השטח שיש לקדוח. הסימנים העליונים והשמאליים נמדדים ב -1 מ"מ מתחת או לרוחב לתפרים העטרה או הסגיטלית, בהתאמה. הסימנים התחתונים והימניים נמדדים ב -4 מ"מ מהתפרים העטרה והקשת, בהתאמה. הקרניוטומיה מתבצעת על ידי קידוח מעגל בתוך הגבולות המסומנים (קו מקווקו), ויוצרת קרניוטומיה בקוטר של כ-3 מ"מ (...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
סטריאוטקס	מכשיר הרווארד	726049
מקדחה מיקרו במהירות גבוהה	מכשיר הרווארד	724950
להב אזמל נירוסטה, #11	MedVet	JOR581S
מלקחיים זוויתיים 5/45	כלים מדעיים משובחים	11251-35
ספוג גקצף 12 ס"מ x 7 מ"מ	פישר	NC9841478
נוגדנים וריאגנטים אחרים	יצרן	מספר קטלוגי	דילול (brightfield) דילול (פלואורסצנטי)
Rb אנטי GFAP	דקו	Z033429-2	1:20k 1:1 אלף
Shp נגד BrdU	אבקאם	dorit_1893	1:2k 1:500
ביוטינילציה עז נגד ארנב	מעבדות וקטוריות	BA-1000	07:40
ארנב Biotinylated נגד כבשים	מעבדות וקטוריות	BA-6000	07:40
Alexafluor 488 עז נגד ארנב	לייף טכנולוגיות	A-11008	07:40
Alexafluor 568 חמור נגד כבשים	לייף טכנולוגיות	A-21099	17:40
DAPI כתם חומצת גרעין	לייף טכנולוגיות	D3571	17:40
קרסיל ויולט אצטט	סיגמא אולדריץ'	C5042-10G	1%