הערכת התיישבות חיידקים במוח עכבר בעקבות זיהום ליסטריה מונוציטוגנים

תקציר

מקור: Ghosh, P., et al., <a href="https://app.jove.com/v/58723">Listeria monocytogenes זיהום במוח. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים את כימות העומס החיידקי הזיהומי ממוח העכבר המחורר הנגוע בליסטריה מונוציטוגנים.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.

1. קצירת איברים וקביעת נטל חיידקי

1. לאחר הזילוח, קצרו איברים (למשל, כבד, טחול) על ידי הסרה זהירה של כל כלי הדם והרצועות המחוברים והנחת האיברים בנפרד לתוך צינור חרוטי סטרילי של 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של קור סטרילי (4 מעלות צלזיוס) PBS. יש לאחסן דגימות על קרח עד לעיבוד נוסף.
2. כדי לקצור את המוח, ערפו את ראשו מאחורי האוזניים באמצעות מספריים וחתכו את עור הקרקפת בין עיני החיה לאורך קו האמצע. במידת הצורך, חותכים רקמה עודפת, תוך שמירה על המספריים צמודים לגולגולת.
   1. מכניסים בעדינות קצה אחד של המספריים לתוך הפתח מגנום (החור בבסיס הגולגולת שדרכו עובר חוט השדרה) וחותכים לרוחב לתוך הגולגולת משני הצדדים.
   2. חתכו בעדינות את הגולגולת בין עיני המכרסם לאורך קו האמצע, תוך הפעלת לחץ רוחבי. הימנעו מהפרעה למוח ושמרו על מגע מינימלי בין רקמת המוח למספריים.
   3. בעזרת מלקחיים עדינים, פתחו את הגולגולת כדי לחשוף את המוח והניחו מרית בין החלק התחתון של המוח לבסיס הגולגולת כדי להסיר את המוח.
      הערה: התוצאה היא קריעה של סיבי עצב במוח.
   4. בזהירות להעביר את המוח לצינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של PBS קר סטרילי.
   5. השליכו את פגר העכבר וחזרו על שלבים אלה עבור החיות הנותרות.
      הערה: לאחר שכל האיברים נקצרו, נקו את אזור ההליך והתכוננו להומוגניזציה של איברים כדי לקבוע עומס חיידקי.
3. נקו ועיקרו את קצה ההומוגנייזר של רקמה שהונח בארון בטיחות ביולוגית על ידי החדרת הקצה והפעלת ההומוגנייזר במשך 10 שניות ברצף באקונומיקה 5%, מים סטריליים, 75% אתנול ומים סטריליים, כל אחד מהם כלול בצינור חרוטי נפרד של 15 מ"ל.
4. הומוגניזציה של המוח הנגוע (~ 20 שניות על הגדרה 6, סל"ד מרבי) בצינור החרוטי 15 מ"ל עד שלא נותרו שברי רקמה נראים לעין.
   1. נקו את ההומוגנייזר כמתואר בשלב 1.3 כדי למנוע זיהום חיידקי לדגימת האיבר הבאה.
   2. בצע את תהליך ההומוגניזציה עבור כל האיברים האחרים (למשל, כבד, טחול).
   3. לאחר השלמת תהליך ההומוגניזציה, נקה את ההומוגנייזר כמתואר בשלב 1.3 ואחסן אותו עד לשימוש נוסף.
5. הכינו דילולים סדרתיים פי 10 של האיבר הומוגנאטים ב-PBS סטרילי ופלטו את הדילולים על לוחות אגר/סטרפטומיצין BHI כדי לקבוע את CFU לכל איבר.
   הערה: שיטה דומה מבוצעת כדי לקבוע את CFU לכל מ"ל של דם.
   1. לאחר שכל הדילולים מצופים, מעבירים את הצלחות לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   2. למחרת, ספרו את מספר המושבות בכל צלחת כדי לקבוע את המספר הכולל של חיידקים לכל איבר או מ"ל דם כדלקמן:
      CFU/איבר = (מספר מושבות x גורם דילול) / מ"ל של הומוגנט מצופה x 5
      CFU/mL של דם = (מספר מושבות x גורם דילול) / מ"ל של מצופה דם

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מדיה עירוי לב במוח	בקטון דיקינסון	237200
סטרפטומיצין סולפט	אמרסקו	0382-50 גרם
צלחות פטרי	VWR	25384-342
גליצרול	VWR	97062-832
IKA T18 ULTRA-TURRAX הומוגנייזר בסיסי	איקה	3352109	דגם: T18BS1
ספקטרופוטומטר	בקמן קולטר	סדרת DU 800
עכברי BALB/c	מעבדת ג'קסון	דגם #000651
חומצה Ethylenediaminetetraacetic	סיגמא-אולדריץ'	60004
15 מ"ל צינורות חרוטיים	VWR	21008-918
מלח חוצץ פוספט	קורנינג	46-013-ס"מ
מרית נירוסטה	VWR	82027-520
מספריים מפלדת אל-חלד (4.5 אינץ')	VWR	82027-578
מלקחיים עדינים מפלדת אל-חלד (6 אינץ')	VWR	82027-406