$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבדיקה אתית של בעלי חיים.
1. פרוטוקול Immunofluorescence
- דיסקציה של רקמות
- להקריב את דגי הזברה על ידי טבילה במי קרח (5 חלקים קרח / 1 חלק מים, 4 ° C); להשאיר אותם עד הפסקת כל תנועה כדי להבטיח מוות על ידי היפוקסיה.
- הסר את הראש עם סכין גילוח. הסר רקמות רכות מהצד הגחוני של הגולגולת עם מלקחיים. פתח את הגולגולת והסר את העצם מהצד הגחוני של המוח. הסר את העור ואת עצמות הגולגולת מהצד הגבי של המוח. הסר את המוח.
- קיבוע רקמות
- תקן את המוח על ידי טבילה במשך 3 שעות ב 4% paraformaldehyde (PFA) ב 4 ° C.
- הכן חיץ פוספט 0.1 M (PB) על ידי המסת 1.755 גרם של NaH2PO4H2O ו- 4.575 גרם של Na2HPO4 ב- 450 מ"ל מים מזוקקים (dH2O) והתאם ל- pH של 7.4 עם הכמות הדרושה של NaOH 1N.
- הכינו 4% PFA המסה 4 גרם של PFA ב 100 מ"ל של 0.1 M PB (pH 7.4) על ידי תסיסה על צלחת חום. כאשר מגיעים לטמפרטורה של 60°C, הוסיפו 2-4 טיפות של NaOH 1N כדי לקבל תמיסה ברורה. שמאל PFA 4% בטמפרטורת החדר (RT) ולשלוט על ה- pH . התאם את ה- pH ל- 7.4.
הערה: זמן הקיבוע תלוי בגודל הרקמות. קיבוע רקמות במשך יותר מ 4-6 שעות עלול להוביל לקיבוע יתר, אשר מסווה אנטיגנים ומגביל קשירת נוגדנים-אפיטופים.
- הטבעה של רקמות
- שטפו את הרקמות 3x במשך 5 דקות כל אחת, עם 0.1 M PB (pH 7.4).
- עבור cryoprotection, להעביר את הרקמות ל 20% סוכרוז PB (0.1 M, pH 7.4) ולשמור לילה על 4 ° C. לאחר מכן, להעביר את הרקמות ל 30% סוכרוז ב 0.1 M PB (pH 7.4) ולשמור ללילה נוסף ב 4 ° C.
- הטמע את הרקמות בגוש של תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT). כדי לעשות זאת, להכין דיואר קטן של חנקן נוזלי, לקחת נייר אלומיניום, לחתוך אותו לשניים כדי ליצור מחבת. יש לטבול את המחבת המכילה את הרקמות המלאות בתרכובת OCT בחנקן הנוזלי עד לקירור תרכובת ה-OCT. ניתן לאחסן את הרקמות הקפואות ב -80 מעלות צלזיוס עד לחתך.
- חיתוך רקמות
- מעבירים את גושי הרקמה הקפואה להקפאה ב -20 מעלות צלזיוס וחותכים בחלקים קורונליים או קשתים של 10 מיקרומטר.
- אספו את הרקמות במקטעים טוריים חלופיים על שקופיות זכוכית דביקות המתאימות לאימונוהיסטוכימיה ואחסנו אותן בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
הערה: אחסן שקופיות בין -20°C ל- 4°C בתיבת שקופיות כהה או בספר שקופיות.
- חסימת אתרי קשירה לא ספציפיים וחדירת רקמות
- סמן את אזור הרקמה בשקופית באמצעות עט עמיד בפני ממסים.
- שטפו את המקטעים 3x במשך 5 דקות כל אחד, עם 0.1 M PB (pH 7.4).
- דגרו על החלקים עם 1% סרום חמור רגיל מומס במאגר החדירה PB-Triton X-100 0.3% (PB-T) למשך 30 דקות ב- RT כדי לחדור את קרום התא ולחסום את אתרי הקישור הלא ספציפיים.
- הכן Triton X-100 0.3% המסה 0.3 מ"ל של Triton X-100 ב 100 מ"ל של 0.1 M PB (pH 7.4).
- הכינו את תמיסת החסימה המסת סרום חמור 1% רגיל ב-PB המכיל 0.3% TritonX-100.
הערה: מיני בעלי החיים של הסרום המשמשים במאגרי החדירה והחסימה תלויים במארח של הנוגדן המשני.
- דגירה עם תערובת של נוגדנים ראשוניים
- שטפו את המקטעים 3x במשך 5 דקות כל אחד, עם 0.1 M PB (pH 7.4).
- לדגור על המדורים במשך הלילה בקופסה לחה ב-RT עם תערובת של נוגדנים ראשוניים מדוללים ב-PB-T. ניתן להשתמש בתערובות הבאות של נוגדנים ראשוניים: נוגדן עיזים כנגד קולטן אורקסין (OX-2R) מדולל 1:100/נוגדן ארנב כנגד קולטן קנבינואידים (CB1R) מדולל 1:100, או נוגדן עיזים כנגד פפטיד אורקסין (OX-A) מדולל 1:100/נוגדן ארנב כנגד CB1R מדולל 1:100.
- דגירה עם תערובת של נוגדנים משניים
- שטפו את המקטעים 3x במשך 5 דקות כל אחד, עם 0.1 M PB (pH 7.4).
- לדגור על הקטעים במשך שעתיים ב- RT עם 1) תערובת של חמור נגד ארנב Alexa Fluor 488-נוגדן משני מצומד וחמור נגד עז Alexa Fluor 594-נוגדן משני מצומד מדולל 1:100 ב- PB-T; או 2) שילוב של חמור נגד עז Alexa Fluor 488-conjugated antibody וחמור נגד ארנב Alexa Fluor 594-conjugated secondary antibody diluted 1:100 in PB-T.
הערה: השתמש נוגדנים משניים שפותחו באותו מארח חיה. הסרום הרגיל חייב להשתייך לאותו מין של נוגדן משני (למשל, להשתמש בנוגדנים משניים שפותחו בחמור ובחמור בסרום רגיל). יש לדלל את הנוגדנים הראשוניים והמשניים באמצעות חיץ חוסם המכיל את חומר הניקוי כדי להגביר את חדירת התאים ולהפחית את הרקע.
- הרכבת רקמות
- שטפו את המקטעים 3x במשך 5 דקות כל אחד, עם 0.1 M PB (pH 7.4).
- כתם נגדי את החלקים עם צבע גרעיני DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) מוכן המסה 1.5 μL של DAPI (1 מ"ג / מ"ל) ב 3 מ"ל של PB.
- שקופיות כיסוי עם אמצעי הרכבה (ראה טבלת חומרים). אמצעי הרכבה מימי זה מייצב את דגימת הרקמה והכתמים לשימוש ארוך טווח. דגימות פלורסנט ניתן לאחסן בחושך ב 4 °C (75 °F). כדי להאריך את חיי הפלואורופורים, השתמש באמצעי הרכבה נגד דעיכה.
הערה: בחר אמצעי הרכבה טוב. אחד הפרמטרים החשובים ביותר של סוכני הרכבה הוא מדד השבירה (nD), אשר צריך להיות סביב 1.5, מדד השבירה של זכוכית. ניתן להשתמש באמצעי ההרכבה המשמש כאן במיוחד עם דגימה שהוכנה לקביעת אנזימים ושומנים (כלומר, דגימה שאסור להתייבש עם סדרה עולה של אלכוהול).
- פקדים
- חזור על סעיפים 1.1-1.8, השמטת הנוגדן הראשוני או המשני, או החלפת בשלב הספציפי באנטיסרה הראשונית או המשנית ב- PB (בקרה שלילית).
- חזור על סעיפים 1.1-1.8, לפני ספיגה של כל נוגדן ראשוני עם עודף של הפפטיד היחסי (100 מ"ג פפטיד / 1 מ"ל של אנטי סרום מדולל).
- חזור על סעיפים 1.1-1.8 על פרוסות מוח עכבר (שליטה חיובית).
הערה: הכינו את כל המאגרים טריים, זמן קצר לפני שמתחילים. הסר את עודף הנוזל בזהירות בכל שלב עם פיפטה או נייר סינון סביב המקטעים, תמיד לשמור על החלק לח.