1. ביסוס מודל BBB
הערה: לביסוס מודל מחסום הדם-מוח (BBB) אנו מציעים להשתמש בתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים (RBMECs) ואסטרוציטים בקליפת המוח של חולדות (RCAs). כל השלבים חייבים להתבצע עם ריאגנטים סטריליים וכלים חד פעמיים המטופלים במכסה מנוע זרימה למינרית.
- תרבית תאים
- צלוחיות תרבית תאים עם פולי-L-ליזין 100 מיקרוגרם/מ"ל (שעה אחת בטמפרטורת החדר, RT) או פיברונקטין 50 מיקרוגרם/מ"ל (שעה אחת ב-37°C) כדי לקדם את החיבור של RCAs או RBMECs, בהתאמה. לאחר מכן, הפשיר 1 x 106 RCAs ו 5 x 105 RBMECs בתווך תאי אנדותל, בתוספת 5% נסיוב בקר עוברי, 1% תוסף גדילה של תאי אנדותל, ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין (sECM). זרעים RCAs בבקבוק T175 ב 20 מ"ל sECM ו RBMECs בבקבוק T75 ב 10 מ"ל sECM.
הערה: יש להתאים את מעברי ההפשרה והזריעה של RCAs ו- RBMECs במונחים של צפיפות תאים וזמן בתרבית בהתאם למספר תנאי הניסוי שיש לבדוק עם מודל BBB. על ידי התחלה עם בקבוקון אחד של 1 x 106 RCAs ובקבוקון אחד של 5 x 105 RBMECs, ניתן להשיג עד 20 תוספות נושאות BBB.
- שמרו על התאים בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 באטמוספירה לחה במשך כ-6 ימים עד לכ-80% מפגש עבור RCAs ומעל 90% מפגש עבור RBMECs. יש לנתק תאים באמצעות תמיסת טריפסין-אתילאנדיאמין חומצה טטראצטית (טריפסין-EDTA) (טריפסין 1:250) למשך 5 דקות (1 מ"ל טריפסין עבור צלוחיות T75 ו-2 מ"ל עבור צלוחיות T175). הפסק את פעילות הטריפסין עם sECM (2:1), מתלי תאי צנטריפוגות ב 750 × גרם למשך 5 דקות, והשהה מחדש את הכדוריות ב 60 מ"ל sECM.
- לפצל את RBMECs ל 3 צלוחיות T175 ותרבית ב sECM עוד 3 ימים לפני הזריעה על תוספות. ספור את המספר הכולל של RCAs חיים על ידי התבוננות בתרחיף תאים מדולל 1:1 עם כחול טריפאן תחת מיקרוסקופ אופטי בתא Burker.
- זריעת תאים על תוספות
- יש לטפל בצד אחד של קרום הפוליאתילן טרפתאלט (PET) של 6 תוספות שקופות מרובות בארות עם פולי-ל-ליזין 100 מיקרוגרם/מ"ל ובצד השני בפיברונקטין 50 מיקרוגרם/מ"ל, כדי לאפשר חיבור של RCAs ו-BMECs. טפלו בתוספות עם פינצטה על מנת למנוע מגע עם קרום ה-PET.
- מניחים את התוספות לתוך צלחת 6 באר ולהוסיף תמיסת פיברונקטין (מינימום 500 μl) לתוך החדר העליון. לאחר שעה של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, להסיר את תמיסת פיברונקטין , לקחת את התוספות מן הצלחת multi-well ולשים אותם הפוך על החלק התחתון של צלחת 150 ס"מ2 פטרי, אשר משמש כאן כתמיכה סטרילית עבור מוסיף מצופה כבר
.
- הוסיפו בעדינות 800 μl של פולי-L-ליזין לצד התחתון של העלון (כפי שמוצג באיור 1A; מה שמכונה זריעת RCA), ושמרו את התמיסה על התוספות למשך שעה אחת ב-RT.
- שאפו את התמיסה ותנו לתוספות להתייבש ב-RT למשך 15-30 דקות. התוספות מוכנות כעת לזריעת תאים, אך ניתן לאחסן אותן גם בצלחת מרובת הקידוחים למשך מספר ימים ב -4 מעלות צלזיוס לפני שתמשיך בבניית BBB.
הערה: זכור לשמור לפחות 3 תוספות מצופות נקיות מתאים שישמשו כפקדים לאימות הקמת BBB על ידי מדידות שטף FD40.
- זרע RCAs (35,000/ס"מ 2) על הצד התחתון של התוספות מצופות פולי-L-ליזין על-ידי הטלת 800 μl של תרחיף תאים על התוספת ההפוכה (איור 1A). השאירו את מתלה ה-RCA על התוספות למשך 4 שעות ב-RT על מנת לאפשר חיבור יעיל של התאים לממברנה.
- שאפו את התמיסה השיורית, הכניסו את התוספות לבארות המכילות 2 מ"ל של sECM, ושמרו על הצלחת מרובת הקידוחים ב 37 ° C ו 5% CO2 באטמוספירה לחה, החלפת sECM כל יומיים.
- לאחר 3 ימים, כאשר RCAs ציפו את הפנים התחתונות של העלון, זרע RBMECs על הצד העליון של העלון, בצע את השלבים הבאים:
- נתק RBMECs מצלוחיות T175 וספור את סך התאים החיים, כפי שדווח בשלבים 1.1.2 ו- 1.1.3.
- זרעים RBMECs (60,000/ס"מ 2) על פני השטח העליונים של האינסרט ב-sECM (1,000 μl) (איור 1B), ומשאירים 3 תוספות עם האסטרוציטים בלבד, שישמשו כרקע התנגדות חשמלית טרנס-אנדותלית (TEER). מניחים את הצלחת מרובת הקידוחים בתנאי תרבית סטנדרטיים. שמור על המערכת לתרבית לפחות 3 ימים, שינוי sECM בחדר הפנימי והתחתון כל 2 ימים.
2. אימות BBB
- מדידת TEER
- ביום השלישי של התרבות המשותפת, בדוק את TEER על ידי הכנסת תוספות נושא BBB לתוך תא מתאים (עם מכסה שבו גם התא וגם המכסה מכילים זוג אלקטרודות חישת מתח וזרם), מלא 4 מ"ל של sECM. התחבר לוולט רקמת אפיתל/אוהממטר.
- יחד עם מדידות TEER של מערכות BBB התא, רשום את ערכי TEER של 3 התוספות הנושאות את ה- RCAs שיופחתו מהערכים המתקבלים עם BBBs. הכפל את ערכי TEER המתקבלים על פני השטח של התוספת (4.2 ס"מ2) על מנת לבטא את התוצאות כ- Ω x ס"מ2.
- מהיום השלישי של התרבות המשותפת, למדוד את TEER כל יום. הערה: לאחר תקופה ראשונית שבה TEER עולה, הערכים המתועדים צריכים להישאר יציבים לפחות יומיים רצופים (בדרך כללבין היום ה -5 ליום ה -7 של תרבות משותפת). בשלב זה, BBB מוכן לשלב השני של אימות (סעיף 2.2) ו / או לניסויים trans-BBB.
הערה: ההליך המתואר בסעיף 2.1 יכול להתבצע על אותן מערכות BBB המוקדשות לניסויי החדירות הבאים (סעיף 3). לפעול בתנאים סטריליים.
3. חדירה טרנס-BBB של פריטינים טעונים FITC (FnN)
הערה: גרסה רקומביננטית של פריטין אנושי (Fn), המיוצרת ב-Escherichia coli ומורכבת בננו-כלובים (FnN). FnN עמוסים באיזותיוציאנט פלואורסצאין (FITC), והריכוזים הן של Fn והן של המולקולות הטעונות נקבעים במדויק.
- שטף Trans-BBB של FITC ו-FITC-FnN
- מדוד את שטף FITC-FnN מהחדר העליון לתחתון של דגמי BBB מאומתים (בדרך כלל ביום ה -5 - 7 של התרבות המשותפת), בהשוואה לזה של הצבע החופשי לאחר 7 ו -24 שעות של דגירה, על פי השלבים הבאים:
- הוסף FITC-FnN (50 מיקרוגרם/מ"ל FnN, 1.1 מיקרומטר FITC) או כמות שווה של FITC חופשי לתוך התא העליון של לפחות 6 מערכות BBB עבור כל נוסחה, על מנת למשוך 2 מ"ל של תמיסת sECM מהחדר התחתון של לפחות 3 תוספות לאחר 7 שעות, ומהחדר התחתון של 3 תוספות אחרות לאחר 24 שעות.
- למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות של 500 μl של הדגימות שנאספו על ידי ספקטרופלואורומטר (λex 488 nm, λem 515 nm, חריץ 5).
- קבל את פלואורסצנטיות הרקע של sECM על ידי מדידת 500 μl של מדיום באמצעות אותם פרמטרים אנליטיים. חסר את פלואורסצנטיות הרקע של sECM מכל ערכי הפלואורסצנטיות של FITC או FITC-FnN.
- קבע את הריכוז של FITC או FITC-FnN חדור על ידי השוואת ערכי הפלואורסצנטיות המתקבלים עם שתי עקומות כיול שונות המיוצרות עם ריכוזים ידועים (כלומר 6.87, 13.75, 27.5, 55 ננומטר) של הצבע החופשי או ננו-מנוסח המומס ב- 500 μl sECM.
