חקר החדירה של FITC ו- FITC-Ferritin באמצעות מודל מחסום דם-מוח במבחנה

תקציר

מקור: Fiandra, L., et al. חדירה חוץ גופית של פריטינים טעונים ב-FITC על פני מחסום דם-מוח של חולדה: מודל לחקר העברת מולקולות ננו-מנוסחות. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מדגים שיטה לחקר חלחול באמצעות מודל מחסום דם-מוח במבחנה (BBB) באמצעות אסטרוציטים ותאי אנדותל על גבי ממברנה, עם פריטין חופשי מסוג FITC ו-FITC. FITC-פריטין נקשר לקולטנים על תאי אנדותל וחצה את מחסום הממברנה לחדר התחתון בעוד FITC חופשי הראה חדירה מוגבלת ונשאר בחדר העליון.

פרוטוקול

1. ביסוס מודל BBB

הערה: לביסוס מודל מחסום הדם-מוח (BBB) אנו מציעים להשתמש בתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים (RBMECs) ואסטרוציטים בקליפת המוח של חולדות (RCAs). כל השלבים חייבים להתבצע עם ריאגנטים סטריליים וכלים חד פעמיים המטופלים במכסה מנוע זרימה למינרית.

1. תרבית תאים
   1. צלוחיות תרבית תאים עם פולי-L-ליזין 100 מיקרוגרם/מ"ל (שעה אחת בטמפרטורת החדר, RT) או פיברונקטין 50 מיקרוגרם/מ"ל (שעה אחת ב-37°C) כדי לקדם את החיבור של RCAs או RBMECs, בהתאמה. לאחר מכן, הפשיר 1 x 10⁶ RCAs ו 5 x 10⁵ RBMECs בתווך תאי אנדותל, בתוספת 5% נסיוב בקר עוברי, 1% תוסף גדילה של תאי אנדותל, ו 1% ....

תוצאות

איור 1: זריעת תאים על תוספות. הליך זריעה RCA (A) ו- RBMEC (B) על שני הצדדים המנוגדים של תוספות הצלחת מרובות הקידוחים.

....

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח חולדה	אינופרוט	P10308	בודד מרקמת המוח של חולדת ספראג דולי, נשמר בהקפאה במעבר הראשון ונמסר קפוא
אסטרוציטים קורטיקליים	אינופרוט	P10202	בודד מ 2 ימים רקמת המוח חולדה, cryopreserved במעבר אחד נמסר קפוא.
ערכת Endothelial Cell Medium	אינופרוט	P60104	ECM (500 מ"ל) וסרום בובין עוברי (25 מ"ל), תוסף גדילה של תאי אנדותל (5 מ"ל) ופניצילין/סטרפטומיצין (5 מ"ל). יש לחמם באמבט מים בטמפרטורה של 37°C לפני השימוש ולהגן מפני אור
טריפסין-EDTA ללא פנול אדום	EuroClone	ECM0920D	יש לחמם באמבט מים בטמפרטורה של 37°C לפני השימוש
פלואורסצאין איזותיוציאנט-דקסטרן 40000	סיגמא	FD40S	הגנה מפני אור
חיץ הפוספט של Dulbecco מלוחים עם Ca ו- Mg	EuroClone	ECB4004L
טריטון X-100	סיגמא	T8787
אלבומין בסרום בקר	סיגמא	A7906
סרום עיזים	EuroClone	ECS0200D
פולי-ל-ליזין הידרוברומיד	סיגמא	עמ' 1274	ניתן להשתמש באותו פתרון מספר פעמים
פיברונקטין מפלזמה של בקר	סיגמא	F1141	ניתן להשתמש באותו פתרון מספר פעמים
תוספות פוליאתילן טרפתאלט (PET)	בז	F3090	ממברנות פוליאתילן טרפתאלט (PET) שקופות; שטח: 4.2 סמ"ר; גודל נקבוביות 0.4 מיקרומטר / שטח פנים
T75 פרימו TC בקבוק	EuroClone	ET7076
T175 פרימו TC בקבוק	EuroClone	ET7181
EVOM2 רקמת אפיתל וולט/אומטר	מכשירים מדויקים עולמיים גרמניה	EVOM2
אנדוהם - 24SNAP	מכשירים מדויקים עולמיים גרמניה	אנדוהם-24סנאפ
מיקרוסקופ אור/פלואורסצנטי עם מצלמה	לייקה מיקרוסיסטמס	DM IL LED Fluo / מודול מצלמה ICC50 W	מיקרוסקופ הפוך לתאים חיים עם מצלמה
מיקרוסקופ קונפוקלי	לייקה מיקרוסיסטמס	TCS SPE