מדידת פעילות פרוטאזום בתאים תת-תאיים שונים במוח החולדה

Abstract

מקור: McFadden, T., et al. כימות פעילות תת-תאית של אוביקוויטין-פרוטאזום במוח המכרסם. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים כיצד למדוד את פעילות הפרוטאזום בתאים תת-תאיים שונים של האמיגדלה הצידית ממוחות של חולדות מותני פחד ולשלוט בהם באמצעות בדיקת פפטיד פלואורוגני. הפרוטאזום חותך את המצע הפפטידי הפלואורוגני, ומשחרר מולקולות פלואורסצנטיות, אשר מכומתות באמצעות קורא לוחות כדי להעריך את פעילות הפרוטאזום בשברים של חלבון גרעיני וסינפטי. פעילות גרעינית מוגברת מצביעה על שינויים בביטוי גנים, בעוד שפעילות סינפטית מופחתת מצביעה על ייצוב חלבונים הנחוץ לתחזוקת הזיכרון לטווח ארוך.

Protocol

1. בדיקת פעילות פרוטאזום

הערה: ניתן למדוד את פעילות הפרוטאזום ברקמת מוח הומוגנית באמצעות גרסה מעט שונה של ערכת פעילות פרוטאזום 20S. בדיקה זו אינה מודדת ישירות את הפעילות של קומפלקסים פרוטאזומים מלאים של 26S. במקום זאת, הוא מודד את הפעילות של ליבת 20S, כלומר הוא יכול לשמש רק כפרוקסי להבנת הפעילות של הליבה עצמה בניגוד לכל קומפלקס פרוטאזום 26S. ההצלחה של בדיקה זו פוחתת עם מחזורי הפשרה חוזרים ונשנים בהקפאה ו/או עלייה ברמות של חומרי ניקוי, במיוחד יוניים, ומחייבת שימוש בקורא לוחות עם מסנן 360/460 (עירור/פליטה) ויכולות חימום של עד 37°C.

1. הגדרות קורא צלחות: יש לחמם מראש ל-37°C ולהחזיק לאורך כל הריצה.​
   1. הגדר עירור ל- 360 ופליטה ל- 460. אם לוח הבאר 96 שבו נעשה שימוש ברור, הגדר את מיקום האופטיקה לתחתית. אם נעשה שימוש בפלטת באר 96 כהה/שחורה, הגדר את מיקום האופטיקה לעליון.
   2. הגדר מודלים ישנים יותר של קורא לוחות לרווח אוטומטי תחת אפשרויות הקריאה הפלואורסצנטית; דגמים חדשים יותר מוגדרים מראש לכך. תכנת ריצה קינטית בזמן של שעתיים, סריקה (קריאה) כל 30 דקות.
2. הרכיבו מחדש את מאגר הבדיקה 10x שסופק בערכה עם 13.5 מ"ל של מים טהורים במיוחד. הוסף 14 μL של 100 mM ATP למאגר 1x כעת; זה משפר באופן משמעותי את פעילות הפרוטאזום בדגימות ומשפר את אמינות הבדיקה. ניתן לאחסן את החיץ הסופי של 20S Assay על קרח או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לצורך, והוא יציב למשך מספר חודשים.
3. לבנות מחדש את תקן AMC שסופק בערכה עם 100 μL של DMSO. בצע שלב זה בחושך או בתנאי תאורה חלשה, מכיוון שהתקן רגיש לאור.
4. צור עקומה סטנדרטית של AMC באמצעות התקן המשוחזר, בחושך או בתנאי תאורה חלשה.
   1. בצינורות מיקרוצנטריפוגות נפרדים של 0.5 מ"ל, הוסף 16, 8, 6.4, 3.2, 1.6, 0.8, 0.4 ו- 0 μL של תקן AMC, המתאים לריכוז AMC של 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0.5 ו- 0 מיקרומטר AMC.
   2. לצינורות אלה, באותו סדר, הוסף 84, 92, 93.6, 96.8, 98.4, 99.2, 99.6 ו- 100 μL של מאגר 20S Assay. זה יוצר סדרה של ריכוזי AMC גבוהים עד נמוכים, אשר ישמשו לכיול קורא לוחות וניתוח של פעילות פרוטאזום בדגימות הומוגניות.
   3. יש לאחסן את כל התקנים המדוללים על קרח בחושך עד לצורך.
5. הרכיבו מחדש את מצע הפרוטאזום (Suc-LLVY-AMC) שסופק בערכה עם 65 מיקרוליטר של DMSO. בצע שלב זה בחושך או בתנאי תאורה חלשה, מכיוון שהמצע רגיש לאור. צור דילול 1:20 של מצע הפרוטאזום בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל באמצעות חיץ 20S Assay. אחסנו את המצע המדולל על קרח בחושך עד לצורך.
   הערה: לדוגמה, אם הצלחת תהיה 10 דוגמאות 1 ריק, תצטרך מספיק מצע מדולל עבור 22 בארות (עם כפילויות) ב 10 μL לכל באר. זה שווה ערך לצורך של 220 μL + 30 μL עבור שגיאות צנרת, הדורשות 12.5 μL של מצע ו- 237.5 μL של חיץ 20S Assay.
6. הפשירו את הדגימות הרצויות (אם הוקפאו) והוסיפו כמות מנורמלת לצלחת 96 בארות. הפעל כל דוגמה בכפילויות. כמות הדגימה הדרושה משתנה בהתאם להכנת הרקמות. באופן כללי, 10-20 מיקרוגרם מספיקים לכל חלק תת-תאי.
7. הביאו את נפח הדגימה היטב ל 80 μL עם מים טהורים במיוחד. הסכום שנוסף תלוי בנפח הדגימה שנוספה. לדוגמה, אם מדגם 1 היה 4.5 μL של חלבון ומדגם 2 היה 8.7 μL, אז כמות המים הדרושה תהיה 75.5 μL ו 71.3 μL, בהתאמה. בשתי בארות נפרדות, להוסיף 80 μL של מים לבד; אלה יהיו Assay Blanks.
   הערה: על מנת להגביל שינויים בנפח החלבון עקב טעויות פיפטציה, ניתן לנרמל את ריכוזי החלבון למדגם הכי פחות מרוכז. פעולה זו תאפשר שימוש באותו נפח דגימה בכל התנאים.
8. הוסף 10 μL של מאגר 20S Assay לכל באר, כולל Assay Blanks. פיפטה מהדר / אוטומטי מומלץ כאן כדי להבטיח נפח בדיקה עקבי על פני בארות.
9. אופציונלי: בשלב זה, הציגו מניפולציות חוץ גופיות אם תרצו; זה ידרוש שלכל דגימה יהיו 2 בארות נוספות לכל טיפול, כולל הרכב. אם כן, הוסף 5-10 מיקרוליטר של תרופה/דריבית ל-2 מבארות הדגימה ונפח שווה ערך של בקרה/רכב ל-2 בארות נוספות. הניחו את הצלחת על קורא הצלחות שחומם מראש או לתוך אינקובטור של 37°C למשך 30 דקות.
10. כבו את האורות או היכנסו לחדר חשוך. הוסף את כל 100 μL של תקני AMC מדוללים לבאר חדשה; לכל תקן תהיה באר אחת.
11. בחושך, הוסף 10 μL של מצע פרוטאזום מדולל לבארות המכילות דגימה ו- Assay Blanks, אך לא לתקן AMC. פיפטה מהדר / אוטומטי מומלץ כאן כדי להבטיח נפח בדיקה עקבי על פני בארות.
12. הכנס את הצלחת לקורא הצלחות והתחל את הריצה הקינטית.
    הערה: הצלחת אינה צריכה להיות תחת תסיסה מתמדת במהלך הריצה הקינטית, עם זאת, המשתמש יכול לבחור אם תרצה
13. בסוף ההפעלה הקינטית, יצא ערכים פלואורסצנטיים גולמיים של 360/460 ל- Microsoft Excel.
    1. ממוצע יחד של בארות כפולות עבור כל תקן, כל דגימה ו- Assay Blank עבור כל 5 הסריקות. ערכי פלורסנט גולמיים אמורים לעלות בסריקות עבור הדגימות, אך להישאר יציבים (או לרדת מעט) עבור תקנים ו- Assay Blanks.
    2. קח את תקן AMC הגבוה ביותר בממוצע היטב וחלק בריכוז הידוע (20 מיקרומטר). חלק ערך זה בריכוז הדגימה המשמש בבדיקה כדי לקבל ערך AMC מתוקנן. עבור כל מדגם וממוצע Assay Blank, חלק בערך AMC המתוקנן.
    3. קח ערך סופי זה וחלק אותו בריכוז הדגימה המשמש בבדיקה כדי לקבל את הערך המנורמל עבור כל דגימה ואת Assay Blank. בצע פעולה זו עבור כל 5 הסריקות.
    4. חסר את הערך הריק המנורמל של Assay מכל ערך דגימה מנורמל עבור כל 5 הסריקות.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ערכת פעילות פרוטאזום 20S	מיליפור סיגמא	APT280	ספקים אחרים נושאים גרסאות שונות
ATP	פישר	FERR1441	ספקים שונים אחרים
קורא לוחות BioTek Synergy H1	ביוטק	VATECHH1MT3	ספקים אחרים נושאים גרסאות שונות
מעכב פרוטאז	מיליפור סיגמא	P8340	ספקים שונים אחרים
DMSO	DMSO	D8418	ספקים שונים אחרים