מאמר שיטה

השגת תרחיפים של תאים מרקמת מוח איסכמית של עכבר

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Pösel, C., et al. בידוד וזרימה ניתוח ציטומטרי של תאי מערכת החיסון ממוח העכבר האיסכמי. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים את ההליך לבידוד תאי מוח ותאי חיסון שחדרו מרקמות מוח איסכמיות של עכברים על ידי עיכול אנזימטי, ולאחר מכן הסרת פסולת תאים ומיאלין על ידי צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות, כדי לחקור תגובות דלקתיות בחקר שבץ.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים הנוגעים לדגימות בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הסקירה האתית המתאימה של בעלי חיים.

1. הכנת ריאגנטים

  1. חיץ עיכול (1 מ"ל לכל חצי כדור): יש להמיס תערובת מתוקננת של אנזימי עיכול מטוהרים, למשל ליבראז עם ריכוז תרמוליזין נמוך (TL) לריכוז של 2U/ml בתמיסת מלח מאוזנת Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) המכילה סידן (Ca) ומגנזיום (Mg).
  2. חיץ שטיפה עם DNAse: להמיס DNAse I לריכוז של 666U / ml ב- HBSS (ללא Ca/Mg (ללא סידן/מגנזיום) המכיל 10% של סרום עגל עובר (FCS).
  3. חיץ כביסה ללא DNAse: HBSS (ללא Ca/Mg) המכיל 10% FCS.
  4. מדיום שיפוע צפיפות (5 מ"ל לחצי כדור): הכינו מדיום שיפוע צפיפות איזוטוני (SIP; 100%) על ידי ערבוב תשעה חלקים של מדיום שיפוע צפיפות עם חלק אחד של נתרן כלורי 1.5 מ'. לדלל את SIP לצפיפות של 25% על ידי הוספת נפח מתאים של HBSS (ללא Ca/Mg) המכיל 3% של FCS.

2. דיסוציאציה של רקמת המוח לתרחיפים של תא בודד

  1. בזהירות להסיר גזע המוח ואת המוח הקטן עם סכין גילוח נקי. השתמש בסכין גילוח נקי כדי לחטט במוח וחתך כל חצי כדור לאורך מישור העטרה לשלוש חתיכות בגודל שווה פחות או יותר.
  2. טחון ניתח רקמה של כל חצי כדור דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר באמצעות קצה הבוכנה של מזרק 5 מ"ל. שטפו ברציפות את מסננת התאים עם HBSS קר כקרח (+Ca/Mg). אחסנו דגימות הומוגניות על קרח.
  3. צנטריפוגה ב 286 x גרם ו 4 ° C במשך 5 דקות, בזהירות להשליך את supernatant. להשעות את הגלולה ב 1 מ"ל של חיץ העיכול ולהעביר את ההשעיה לתוך צינור 2 מ"ל. יש לדגור על המתלים בסיבוב רציף איטי ב-37°C למשך שעה אחת.
  4. יש לנפות את תרחיף התא דרך מסננת תאים בגודל 70 מיקרומטר ולשטוף ביסודיות עם 3 מ"ל של מאגר כביסה המכיל DNAse ואחריו 15 מ"ל של מאגר כביסה ללא DNAse. צנטריפוגה ב 286 x גרם ו 18 ° C במשך 5 דקות ו להשליך את supernatant. הערה: השימוש ב- DNAse מבטל ריר DNA הנגרם על ידי ליזה של תאים, מה שעלול להוביל לצבירת תאים, ולסכן את הישרדות התא.

3. צנטריפוגת שיפוע צפיפות לסילוק מיאלין ופסולת תאים

  1. משעים מחדש את גלולת התא ב 5 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות 25% ופיפטה את התרחיף לצינור 15 מ"ל. מערבבים היטב על ידי פיפטינג חוזר ועדין, ומונעים היווצרות בועות. הערה: יש להשתמש בתווך שיפוע צפיפות ב- RT כדי למנוע גושי תאים.
  2. צנטריפוגה ב 521 x גרם ו 18 ° C במשך 20 דקות. השתמש בפרופיל התאוצה הנמוך ביותר של הרוטור ואפשר לרוטור לעצור ללא בלם. הוציאו בעדינות את הצינורות מהצנטריפוגה מבלי לרעוד. שאפו בזהירות את שכבת המיאלין ואת הסופרנאטנט תוך שמירה על כדורית התא בתחתית הצינור. הערה: הקפידו להסיר את כל שכבת המיאלין, שכן כל שאריות יפגעו בניתוח הציטומטרי של הזרימה.
  3. יש להשהות מחדש את הגלולה ב-10 מ"ל של חיץ כביסה ללא DNAse ולפיפטה את התרחיף לצינור חדש של 15 מ"ל. הערה: שלב שטיפה זה הוא קריטי מכיוון שהסרה מספקת של מדיום שיפוע צפיפות תורמת באופן משמעותי לכמות ואיכות דגימת התא הסופית.
  4. צנטריפוגה שוב ב 286 x גרם ו 10 ° C במשך 5 דקות ולהשליך את supernatant. להשהות מחדש תאים ב 100 μl של חיץ כביסה קרה ולקבוע את ספירת התאים ואת הכדאיות על ידי הרחקת כחול טריפאן בהמוציטומטר. אחסנו דגימות בטמפרטורה של 4°C והמשיכו לעבד אותן במהירות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מסובב צינור MACSmixMiltenyi ביוטק GmbH
Heraeus Multifuge 3SR+תרמו סיינטיפיק
תמיסת מלח חוצצת של האנק (HBSS)Gibco/Life Technologies GmbH14175-129
HBSS עם סידן/מגנזיוםGibco/Life Technologies GmbH24020-091
Liberase TLRoche Diagnostics GmbH5401020001לשימוש בטמפרטורת החדר
פרקול פלוסGE Healthcare אירופה GmbH17-5445-01
סרום בקר עובריפאן ביוטק3302-P101003
כחול טריפאןGibco/Life Technologies GmbH15250-061
טרוקונטBD Biosciences340334
פוספט מלח חוצץBiochrom AGL 182-10
DNase IRoche Diagnostics GmbH11284932001
צינורות סיליקון, 1mמכשירים מדויקים בעולם503022
קשתית עדינה מספריים חדים/בוטיםכלים מדעיים משובחים14028-10
מלקחיים ישרים 1x2 שינייםכלים מדעיים משובחים11021-14
מלקחיים קהיםכלים מדעיים משובחים11008-13
בוכנה מזרק 5 מ"לCarl Roth GmbH (בראון)EP96.1
מסננת תאים, 100 מיקרומטרד"ר א. שוברט, BD2360-00
מזרק Omnican Fine מינון 1MLבראוןTBD
מסננת תאים, 70 מיקרומטרגריינר Bio-One GmbH542 070
פיפטות סרולוגיות, 10 מ"לגריינר Bio-One GmbH607180
פיפטות סרולוגיות, 10 מ"לSarstedt AG&Co86,12,54,025
פיפטות סרולוגיות, 25 מ"לגריינר Bio-One GmbH760180
פיפטות סרולוגיות, 5 מ"לגריינר Bio-One GmbH606180
פיפטות סרולוגיות, 25 מ"לSarstedt AG&Co86,16,85,020
פיפטות סרולוגיות, 5 מ"לSarstedt AG&Co86,12,53,025
טיפים, 0,1-10μlמדעי B.V.Life קורנינג4840
טיפים, 100-1000μlגריינר Bio-One GmbH740290
טיפים, 10-200μlגריינר Bio-One GmbH739296
צינורות תגובה 1,5 מ"לגריינר Bio-One GmbH616201
צינורות תגובה 2mlגריינר Bio-One GmbH623201
צלחת פטרי בקטריולוגית, 94x16 מ"מגריינר Bio-One GmbH633180
פלקון 15 מ"לגריינר Bio-One GmbH188271
פלקון 50 מ"לVWR הבינלאומי GmbH (BD)734-0448
המוציטומטר נויבאוארBiochrom AGPDHC-N01
סכין גילוחקרל רוט GmbHCK07.1

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Cell Suspension IsolationEnzymatic DigestionDensity Gradient CentrifugationImmune Cell AnalysisFlow CytometryTissue MincingCell FiltrationMyelin RemovalDebris Separation

מאמרים קשורים