השראת דיסקינזיה הנגרמת על ידי לבודופה במודל חולדה של מחלת פרקינסון

תקציר

מקור: Caulfield, M. E., et al. אינדוקציה והערכה של דיסקינזיות המושרות על ידי לבודופה במודל חולדה של מחלת פרקינסון. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מדגים את התהליך של גרימת דיסקינזיות המושרות על ידי לבודופה במודל חולדות פרקינסון על ידי מתן לבודופה לצד מעכב המרת דופמין. זריקות חוזרות ונשנות מעוררות יתר על המידה את נוירוני המוח, וכתוצאה מכך תפקוד מוטורי לקוי.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת ריאגנטים ואספקה

1. לקבוע L-3,4-dihydroxyphenylalanine methyl ester hydrochloride (levodopa או L-DOPA) ו benserazide hydrochloride, מעכב decarboxylase היקפי (ראה טבלה של חומרים) מינון, תדירות דירוג, ציר זמן הניסוי המתאים לשאלה המחקרית (איור 1).
   הערה: ניתן להציג שאלות מחקריות כדי לחפש מספר רב של תשובות, החל מהשאלה האם טיפול ספציפי עשוי להפחית דיסקינזיות קיימות המושרות על ידי L-DOPA (LID) ועד למניעת השראת LID. הם יכולים גם לחקור אם יעילות טיפולית תלויה במינון של levodopa או אם ביטוי LID ו / או יעילות טיפולית משתנה בהתאם למין, מין, וגיל של הנושא.
2. שקלו חולדות מדי שבוע כדי לחשב את כמות התרופה המתאימה בהתבסס על השינויים המתמשכים במשקל במהלך המחקר.
   הערה: בשל פעילות מוגברת בחולדות LID+, קיים פוטנציאל לירידה במשקל עם טיפולי L-DOPA ארוכי טווח. אם מתרחשת ירידה במשקל, ספקו לחולדות פינוקים מלאים מבחינה תזונתית וטעימים מאוד (ראו טבלת חומרים) לאחר זריקות L-DOPA.
3. חישוב כמות L-DOPA ובנסרזיד הנדרשת עבור כל ריכוז שבועי, שקילת aliquots lyophilized עבור כל יום של הזרקה ואחסון בשילוב במשך 1-2 שבועות ב -20 ° C בבקבוקוני ענבר זכוכית עד ליום הטיפול.
   הערה: מינון היעד הוא 12 מ"ג/ק"ג או 12 מ"ג L-DOPA/1000 גרם משקל גוף. מידע משלים מספק דוגמה לחישובים לקביעת כמות L-DOPA ומי מלח הדרושים לכל יום בשבוע באמצעות 12 מ"ג L-DOPA / ק"ג משקל גוף בנפח הזרקה של 1 סמ"ק / ק"ג משקל חולדה.

2. הגדרת חדר וכלוב

1. ביום הראשון לטיפול ב-L-DOPA 3-4 שבועות לאחר ניתוח נגע 6-הידרוקסידופמין (6-OHDA), מעבירים חולדות לדיור יחיד, כולל העשרה שאושרה על ידי IACUC.
2. שמרו על דיור יחיד לאורך כל המחקר כדי למנוע הפרעה של עמיתים להערכות התנהגותיות.
3. בימי דירוג LID, הניחו את הכלובים הביתיים על מתלה תיל פלדה, כשהוא מסובב בזווית של כ-45° לצפייה מיטבית בחולדה (איור 2A). הפכו את תגי הזיהוי (איור 2B) כלפי מעלה והוציאו בקבוקי מים, מדפי מזון ואת כל סוגי ההעשרה בכלוב (איור 2C) כדי למנוע הפרעה להערכות התנהגותיות.

3. זריקות לבודופה ודירוג דיסקינזיה

1. הזרקות תת עוריות של L-DOPA
   1. מיד לפני ההזרקה היומית של L-DOPA, יש להוסיף את הנפח המתאים של מי מלח סטריליים לתערובת L-DOPA ובנסרזיד שנשקלה מראש בבקבוקון הענבר ולנער היטב במשך 10 שניות (שלב 1.3).
      הערה: נפח הזרקת היעד הוא 1 מ"ל/1000 גרם משקל גוף (עם 12 מ"ג L-DOPA למ"ל). נפח המלח הסטרילי יהיה תלוי במספר בעלי החיים בכל מחקר.
   2. מלא מזרקים בודדים (לדוגמה, 1.0 או 0.5 מ"ל עם מחט 26 גרם) בנפח הדרוש לכל חיה (1 מ"ל / ק"ג משקל חולדה) ותייג כל מזרק עם זיהוי בעל חיים נפרד.
      הערה: יש לשמור את המזרקים המלאים מוגנים מפני אור בשקיות סטריליות עד למועד ההזרקה. L-DOPA מתחמצן במהירות בנוכחות חמצן ואור בסביבה מימית.
   3. הביאו את הכלוב הראשון לספסל ההזרקות.
   4. הוציאו את החולדה מהכלוב והניחו אותה על משטח ההזרקה.
   5. מרסנים בעדינות את הראש והכתפיים כנגד המשטח שעליו נחה החולדה עם כף היד הלא דומיננטית.
   6. יש לשפשף בעדינות את העור על הגב מעל עצם השכמה בעזרת האגודל והאצבע של היד הלא דומיננטית. לאחר מכן, הזריקו נפח L-DOPA עם היד הדומיננטית לחלל התת עורי בין / מתחת לאצבעות, תוך שמירה על המחט מקבילה לגוף ככל האפשר כדי למנוע הזרקה תוך שרירית.
      הערה: החולדות אינן מורדמות לפני ההזרקה.
   7. יש להשליך כל מזרק בודד משומש במיכל חד.
   8. החליפו את החולדה בכלוב האישי שלה והוסיפו חטיפים מלאים מבחינה תזונתית למעט בימי דירוג LID כדי למנוע הפרעה להערכות התנהגותיות עד לאחר השלמת הדירוג.
   9. כוונו את הטיימר למשך 1-2 דקות בהתאם לזמן הדירוג הרצוי ולמספר החולדות במחקר בימי הדירוג. שלפו את הכלוב הבא והזריקו את החולדה הבאה כאשר הטיימר מציין.
   10. חזרו על כך, הזריקו חולדה אחת כל 1-2 דקות, עד שכל החולדות מוזרקות.
2. דירוג דיסקינזיה הנגרמת על ידי לבודופה לאחר הזרקה
   1. דרג את העוצמה (טבלה 1) והתדירות (טבלה 2) של תנועות דיסקינזיה דיסטוניות והיפרקינטיות במספר נקודות הזמן הרצוי, אשר אמור לכלול את ההתחלה הראשונית של התנהגות LID, התנהגות שיא ושלב הירידה.
   2. עבור זכרים ונקבות בוגרים Sprague Dawley או Fisher 344 חולדות, וגודל מדגם של N = 40 חולדות, יש להתחיל את דירוג הדיסקינזיה 20 דקות לאחר זריקת L-DOPA הראשונה, ולאחר מכן במרווחים של 50 דקות עד 220 או 270 דקות לאחר ההזרקה, תלוי מתי התנהגויות LID הופסקו ב-90%-100% מהחולדות.
   3. אם אתם משתמשים במרווחי דירוג של דקה אחת, כוונו טיימר לדקה אחת. דרגו את החולדה הראשונה למשך דקה אחת. עברו לחולדה הבאה ודרגו אותה במשך דקה. המשך דרך כל החולדות, דירוג עבור 1 דקות מרווחים.
   4. הצב טיימר ליד הכלוב באופן גלוי לעין, כך שניתן יהיה לצפות בעוצמת התנהגות LID (טבלה 1) תוך הערכת התדירות של כל התנהגות נתונה (טבלה 2) במהלך תקופת הדירוג.
   5. לאחר השלמת הדירוגים של נקודת הזמן הראשונה, התחל שוב עם החולדה הראשונה בנקודת הזמן הבאה (למשל, 70 דקות לאחר ההזרקה) והמשך במרווח הזמן הרצוי (למשל, כל 50 דקות) עד להשלמת כל נקודות הזמן.
      הערה: בשל החפיפה בין משימות הזרקת L-DOPA ודירוג LID, נדרשים שני אנשים בימי הדירוג, אחד להזרקה ואחד לדירוג התנהגותי.

תוצאות

איור 1: דוגמה לציר הזמן של הטיפול. דוגמה ציר זמן של העלאת מינון L-DOPA של 12 שבועות באורך כולל, עם 8 שבועות של זריקות L-DOPA החל 3 שבועות לאחר נגע 6-OHDA ו -4 שבועות לאחר טיפול ניסיוני. בדוגמה זו, L-DOPA מוזרק תת עורית 5 פעמים בשבוע (שני עד שישי) בערך באותה שעה בכל יום, במשך שבועיים בכל מינון L-DOPA שנקבע (3, 6, 9 ו -12 מ"ג / ק"ג). דירוגי LID התנהגותיים מתקיימים בימים 1, 6 ו-10 של כל רמת מינון של L-D...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
טיימר דיגיטלי של 100 דקות	סיכות	1111764
Compass CX Compact Scale	אוהאוס	30428202
5-(2-אמינואתיל)-1,2,4-בנזנטריול, מונוהידרוברומיד	קיימן כימיקלים	25330	6-OHDA הוא רעלן עצבי קטכולמינרגי המשמש לגרימת נגעים דופמינרגיים ותסמינים פרקינסוניים במכרסמים.
כלובי אלנטאון	אלנטאון, LLC	Rat900	כלובי אלנטאון מספקים את היכולת לראות את החולדות מכל עבר.
מגשי אלרגיסט BD עם מחט מחוברת לצמיתות	ב.ד.	BD 305540	לזריקות L-DOPA תת עוריות
בנסרזיד הידרוכלוריד	סיגמא-אולדריץ'	B7283	Benserazide הוא מעכב decarboxylase היקפי המשמש עם L-DOPA כדי לגרום dyskinesia במודלים מכרסמים של PD.
בקבוקוני נצנוץ ענבר זכוכית	תרמו סיינטיפיק	B7921	משמש לאחסון L-DOPA/benserazide בטמפרטורה של -20°C עד לערבוב עם מי מלח סטריליים.
L-3,4-דיהידרוקסיפנילאלנין מתיל אסטר הידרוכלוריד	סיגמא-אולדריץ'	D1507	L-3,4-Dihydroxyphenylalanine methyl ester הוא קודמן של L-DOPA החוצה את מחסום הדם-מוח ומשמש לטיפול בתסמיני פרקינסון במכרסמים.
נייר Mate Sharpwriter עפרונות מכניים	סיכות	107250
פינוקי העשרה תזונתיים מלאים של מכרסמים	ביו-סרב	F05478
דלי קרח עגול עם מכסה, 2.5 ליטר	קורנינג	432129
לוח פלסטיק סטנדרטי	סיכות	1227770
יחידות מדפים ניידות באורך 6 אינץ' מחווט פלדה	אולין	H9488	ניתן להתאים רוחב/גובה לפי הצורך/מספר החולדות בכל ניסוי
מלח סטרילי 0.9%	קובידין/ארגייל	1020	לערבוב עם L-DOPA/bens