זיהוי הזדקנות עצבית בחתך אורגנואיד בקליפת המוח

תקציר

מקור: Shaker, M. R., et al. יצירה חזקה וניתנת לשחזור של אורגנואידים במוח למידול הזדקנות עצבית במוח במבחנה. J. Vis. Exp. (2022).

סרטון זה מדגים את השיטה לזיהוי נוירונים מזדקנים בחלקים אורגנואידיים בקליפת המוח על ידי צביעה לפעילות בטא-גלקטוזידאז, המוגברת בתאים מזדקנים. האנזים חותך מצע כדי לייצר תוצר כחול, ואחריו תצפית מיקרוסקופית על הנוירונים המוכתמים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות ה-IRB של המכון.

1. אפיון הזדקנות עצבית באורגנואידים בקליפת המוח

1. עיבוד אורגנואידים בקליפת המוח עבור קריוסקציה:
   הערה: השלבים בוצעו במכסה מנוע של בטיחות ביולוגית Class 2.
   1. הכן 2 צינורות מ"ל, כל אחד מלא ב -1.5 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד (PFA).
   2. חותכים את קצה הפיפטה P1000 (כדי להפוך אותו לקדח רחב) ומעבירים בעדינות כל אורגנואיד לאחד מצינורות 2 מ"ל שהוכנו לעיל (אורגנואיד אחד לכל צינור).
      הערה: כדי למנוע ערבוב עודף של אמצעי התמיינות (DM) עם ה-PFA, אפשר לאורגנואיד לשקוע לכיוון הפתח של קצה הפיפטה P1000 והנח את הקצה ממש מעל החלק העליון של ה-PFA בצינור לפני הוצאת האורגנואיד החוצה. זה יאפשר לחוקר להעביר רק את האורגנואיד ומדיה מינימלית מאוד.
   3. אפשר לתהליך הקיבוע להתרחש ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
   4. בעזרת קצה פיפטה P1000 לא חתוך, שאפו בזהירות עודפי PFA והוסיפו 1.5 מ"ל של PBS קר 1x (מי מלח חוצץ פוספט).
   5. העבירו את הצינורות לשייקר מסלולי המוגדר על 70 סל"ד למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
   6. חזור על תהליך הכביסה עם PBS 1x קר שלוש פעמים כדי להבטיח שכל ה-PFA הוסר ביסודיות.
      הערה: אין להשליך PFA למיכלי פסולת רגילים; במקום זאת, הכינו מיכל ספציפי לפינוי פסולת כימית לשם כך, מכיוון ש-PFA מהווה סכנה.
   7. טבלו את האורגנואידים ב-1x PBS המכיל 30% סוכרוז ודגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שכל האורגנואידים שקעו לתחתית הצינור.
      הערה: הזמן הדרוש לאורגנואידים לשקוע תלוי בגודלם ובגילם. אורגנואידים בני שלושה חודשים עשויים להימשך עד 5 שעות.
   8. בעזרת קצה פיפטה P1000 חתוך ורחב קדח, העבירו בעדינות שלושה עד חמישה אורגנואידים לתבנית הרכבה המכילה תמיסת הרכבה העשויה מ-30% סוכרוז ו-100% טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) בינונית ביחס של 3:2.
   9. השתמש בקצה פיפטה של 10 מיקרוליטר בעזרת סטריאומיקרוסקופ כדי לכוון ולמקם אורגנואידים בתבנית דמוית רשת.
   10. הנח את התבנית על קרח יבש כדי למצק את תמיסת הסוכרוז OCT לפני שתמשיך בחתך הקפאה (16-20 מיקרומטר) באמצעות קריוסטט.
       הערה: עבור בטא-גלקטוזידאז הקשור להזדקנות, יש לעבד את כל הרקמות לחלוקה לאחר שהן שקעו. עבור אימונופלואורסצנטיות, ניתן לעבד רקמות לחיתוך למחרת. אם לא מוכתמים מיד, יש לאחסן את כל השקופיות המכילות קטעים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לפני אימונופלואורסצנציה או בטא-גלקטוזידאז לאחר מכן.
2. תהליך לניתוח הזדקנות באורגנואידים במוח קליפת המוח:
   הערה: ניתן לבצע את השלבים הבאים על ספסל מעבדה רגיל.
   1. העבירו את השקופיות למיכל צביעת שקופיות מיקרוסקופ עם מכסה ושטפו את רקמת האורגנואיד החתוכה שלוש פעמים עם 1x PBS למשך 10 דקות ב-RT כדי להסיר כל תמיסת הרכבה עודפת.
   2. לאחר מכן, דגרו את הרקמה השטופה בתמיסת צביעה בטא-גלקטוזידאז טרייה למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: תמיסת הצביעה של בטא-גלקטוזידאז עשויה ממאגר פוספט (עבור 10 מ"ל של מאגר פוספט: 8.15 מ"ל של 1 מ"ל NaH₂PO₄, 1.85 מ"ל של 1M Na₂HPO₄) pH מותאם = 6, 100 מ"מ של אשלגן הקסציאנופראט (III), 100 מ"מ של אשלגן הקסציאנופראט (II) טריהידרט, 5 מ' של NaCl, 1 מ' של MgCl₂, 20 מ"ג/מ"ל של X-Gal. הימנע משימוש באינקובטור תרבית תאים סטנדרטי המכיל CO₂ מכיוון שה-CO₂ ישנה את ה-pH של תמיסת הצביעה בטא-גלקטוזידאז.
   3. כדי להסיר את תמיסת הבטא-גלקטוזידאז, שטפו את הרקמות המוכתמות עם 1x PBS שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחת ב-RT.
   4. הרכיבו את הרקמות השטופות עם תושבת זכוכית נגד דהייה ואפשרו לתמיסת ההרכבה להתמצק למשך 30 דקות ב-RT לפני הצפייה במיקרוסקופ.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
16% פורמלדהיד (W/V) ללא מתנול	תרמו פישר מדעי	28908	4% מה-PFA מדוללים ב-1x PBS
מיקרוסקופ CKX53 עם מצלמת SC50	אולימפוס
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	סיגמא אולדריץ' בע"מ	D1408-500ML
מדיום נוירו-בסיסי	תרמו פישר מדעי	21103049	בשימוש במדיה DM
OCT Embedding Compound Sakura Clear (118 מ"ל/בקבוק)	Tissue Tek	4583
אשלגן הקסציאנופרט (II) טריהידרט	סיגמא אולדריץ' בע"מ	CP1087
אשלגן hexacyanoferrate(III)	סיגמא אולדריץ' בע"מ	455946
תושבת אנטי-דהייה מזכוכית מאריכה	לייף טכנולוג'יז אוסטרליה (TFS)	P36980
סוכרוז	סיגמא אולדריץ' בע"מ	PHR1001-1G	30% מהסוכרוז מדולל ב-1x PBS