טיפול בהתקפים הנגרמים על ידי עכבר

תקציר

מקור: Batot, G., et al. מודל לאפילפסיה של אטיולוגיה זיהומית באמצעות נגיף דלקת המוח של העכברים של טיילר. J. Vis. Exp. (2022).

סרטון זה מדגים את השראת השראת התקפים הנגרמים על ידי טיפול בעכבר שנדבק בנגיף דלקת המוח העכברי של טיילר (TMEV). העכבר הנגוע, שיש לו נוירונים מעוררי יתר, חשוף לגירויים פיזיים חיצוניים. חשיפה זו גורמת למתח, מה שמוביל לפעילות חשמלית חריגה בתאי העצב, מה שגורם להתקפים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. חיסון נגד וירוסים

1. עיקור מזרק ההזרקה
   1. הסר את מכסה מזרק האינסולין. הוסף צינורות פוליאתילן כצווארון סביב המחט כדי להבטיח עומק הזרקה הולם של 2.5 מ"מ. טבלו את המזרק באתנול למשך 30 דקות. הנח את המזרק מתחת לאור UV למשך 30 דקות.
   2. החזר את הפקק למחט. עטפו את המזרק בשקית חיטוי וסגרו אותו בסרט הדבקה. יש להדביק תווית עם תאריך ההכנה.
2. הזרקת וירוסים
   1. קבל כמויות של זן ה-TMEV של דניאל מהמקפיא של -80 מעלות צלזיוס. להפשיר את הנגיף ולהשאיר אותו על הקרח. הימנע מהפשרה והקפאה מחדש של הנגיף. טען את המזרק בתרחיף הנגיף (3 x 10⁵ יחידה יוצרת פלאק [PFU] מדוללת ב-20 מיקרוליטר של מי מלח עם חוצץ פוספט [PBS] או מדיום תרבית הנשר המותאם של Dulbecco [DMEM]).
      זהירות: הנגיף מדבק בעכברים אך לא בבני אדם.
   2. נקו את הספסל עם חומר חיטוי ועבדו מתחת לבולם אדים. חיסון נגד נגיף אינו סטרילי אך נקי ככל האפשר.
   3. העבירו את העכבר לתא האינדוקציה של ההרדמה והשתמשו ב-2% איזופלורן בחמצן כדי לגרום להרדמה. הגעה לסובלנות כירורגית אורכת מספר דקות; התאם את הריכוז על סמך נשימת החיה ועומק ההרדמה.
   4. העבר את העכבר המורדם מקופסת ההרדמה מתחת למכסה המנוע. בדוק סובלנות כירורגית, למשל, על ידי צביטת הבוהן. ההליך כולו מבוצע בפחות מ -30 שניות, כך שהחיה אינה צריכה לשאוף איזופלורן במהלך ההזרקה. יש להוסיף משחה לעיניים למניעת התייבשות הקרנית.
   5. נקו את ראש החיה בעזרת כרית אלכוהול. הטה את ראש העכבר מעט שמאלה כך שמקום ההזרקה יפנה כלפי מעלה.
   6. משוך את העור מעט לאחור, הכנס את המחט לראש והזריק 20 מיקרוליטר תוך קורטיבית לעומק של 2.5 מ"מ באזור הטמפורלי של ההמיספרה הימנית (אחורי ומדיאלי לעין ימין).
   7. בצע את ההזרקה באופן חד צדדי באותה המיספרה בכל בעלי החיים. השתמש בעין ובאוזן כציוני דרך למיקום קליפת המוח הקודקודית. המיקום אומת בעבר מבחינה היסטולוגית; ראה איור 1. קואורדינטות ההזרקה על פי הזרקה סטריאוטקסית ביחס לברגמה הן -2.0 (AP); +3.0 (מ"ל); -1.5 (DV).
   8. השאירו את המזרק במקומו למשך 5-15 שניות. רשמו אם יש דליפה מהזרקה או אם נראות בועות אוויר - במקרה כזה, הכינו מזרק חדש. כאשר שולפים בזהירות את המזרק החוצה, סובבו אותו מעט. יש למרוח משחת עיניים למניעת יובש בהרדמה.
   9. אופציונלי: קודד את החיה על הזנב או האוזן בהתאם לנהלים המקומיים (אופציונלי אך קל מכיוון שהחיה מחוסרת הכרה).
   10. העבירו את בעל החיים לכלוב חדש, המונח חצי על/חצי משטח חימום (35-40 מעלות צלזיוס) במהלך ההתאוששות מההרדמה. אל תשאיר את בעלי החיים ללא השגחה עד שהם חזרו להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה על החזה.
       הערה: ניתן לשכן בעלי חיים שוב לאחר ההחלמה (בעלי חיים נגועים אינם מעורבבים עם בעלי חיים נגועים מדומים). אין לשכן עכברים נגועים באותו חדר עם עכברים שאינם נגועים.
   11. עקוב אחר משקל העכברים במשך 7 הימים הראשונים לאחר ההדבקה מכיוון שהם יורדים במשקל לאחר ההדבקה ועשויים להזדקק להאכלה נוספת.

2. ניטור התקפים של התקפים הנגרמים על ידי טיפול

1. בצע הליך זה על ידי נסיין עיוור לטיפול. הביאו את כל הכלובים לספסל. התבונן בבעלי החיים להתקפים פעמיים ביום במהלך שלב האור.
2. ציון פעילות ההתקפים בסולם רסין שונה: 0 = ללא שינוי בהתנהגות, 1 = תנועות פה ופנים, 2 = הנהון ראש, 3 = קלונוס חד צדדי של הגפה הקדמית, 4 = קלונוס דו-צדדי של הגפה הקדמית עם גידול, 5 = פעילות טונית-קלונית כללית עם אובדן טונוס יציבה, לפעמים קפיצה, 6 = קפיצה ממושכת ומוגזמת והיפראקטיביות. דווח על מספר ועוצמת ההתקפים.
3. החלק עט על פני הכלוב כדי להשמיע קצת רעש.
4. מעבירים כל חיה לקופסה אחרת ובחזרה.
5. נענע בעדינות את הכלוב בתנועה קדימה ואחורה, הקפד לא לנער את הכלוב בעוצמה כזו שבעלי חיים יפגעו בצדדים או בחלק העליון של הכלוב ויהיו בסכנת פגיעה פיזית.
6. עקוב אחר כל בעלי החיים בכלוב לאיתור התקפים. בכל עת, אם לעכבר יש התקף, העבירו אותו בחזרה לכלוב הביתי ורשמו את רמת ההתקף ללא גירוי נוסף של ההתקף על ידי רעש או טיפול.
7. עבור בעלי חיים שלא נתפסו באופן ספונטני או לאחר טלטול עדין בכלוב, עוררו התקפים על ידי טיפול אינטנסיבי יותר: הפכו בזהירות את העכבר על ידי הפיכתו בזנבו משמאל לימין.
   הערה: בעלי חיים עם התקפים הם בעלי ריגוש יתר ויכולים להיות קופצניים.
8. התבונן שוב בכל בעל חיים להתנהגות התקפים. חזור על התהליך עבור הכלובים הבאים.

תוצאות

איור 1: סכמטי של הליך הזרקת TMEV. משמאל לימין: עבור הזרקת קליפת המוח הקודקודית הימנית, המחט מוזרקת מעט לרוחב של קו דמיוני בין העין לאוזן הנגדית. הצווארון לבקרת עומק מסומן בצהוב. ניתן לראות את דרכי ההזרקה בחלק המוח העטרתי, המסומן על ידי החץ. אתר ההזרקה מתאים לקואורדינטות שניתנו מעל החץ. התמונה הימנית מראה את התפלגות וירוס Theiler (סגול) בתוך CA1 של תצורת ההיפוקמפוס. הדמות הוכנה באמצעות biorender.com.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
איזון בעלי חיים	אוהאוס (פרסיפני, ניו ג'רזי, ארה"ב)	STX2202	0.01 גרם–2200 גרם
מזרקי אינסולין BD Lo-Dose U-100	BD (מיסיסוגה, אונטריו, קנדה)	BD329461	מזרקים סטריליים Lo-Dose עם מחט BD Micro-Fine IV קבועה - 1 מ"ל
זן דניאל של TMEV	סופק באדיבות על ידי רוברט פוג'ינאמי (אוניברסיטת יוטה)	-	3 x 105 יחידות יוצרות פלאק aliquot(s)
חומר חיטוי, למשל VennoVet 1 super	Menno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, גרמניה	-	מומלץ על ידי וטרינרים בקמפוס עם פחות או שווה ל-5% אלכוהול
פישרברנד פד הכנה לאלכוהול סטרילי בינוני C7	תרמו פישר סיינטיפיק (וולת'ם, מסצ'וסטס, ארה"ב)	22-363-750
פלוריסו	VETone (Boise, ID, U.S.A)	502017	איזופלורן 250 מ"ל, 2%–5%
סופג אדים	Labconco (קנזס סיטי, מיזורי, ארה"ב)	-	-
הגנה כללית מעילי מעבדה לבנים SMS חד פעמיים	תרמו פישר סיינטיפיק (וולת'ם, מסצ'וסטס, ארה"ב)	17-100-810A
דלי קרח	-	-	any
כלוב עכבר	-	-	כל כלוב עכבר שמכיל לפחות 5 עכברים
מחטי PrecisionGlide	BD (מיסיסוגה, אונטריו, קנדה)	329652	קצה החלקה BD עם מזרקי אינסולין מחט PrecisionGlide - 26 גרם x 3/8 - 0.45 מ"מ x 10 מ"מ
נרתיק עיקור איטום עצמי	פישר סיינטיפיק (המפטון, ניו יורק, ארה"ב)	NC9241087	12.6 x 25.5 ס"מ
בקבוק זכוכית קטן	-	-	any, volume 25 mL
PBS סטרילי	תרמו פישר סיינטיפיק (וולת'ם, מסצ'וסטס, ארה"ב)	10010056
מזרק לואר-לוק	BD (מיסיסוגה, אונטריו, קנדה)	309628	1 מ"ל מזרק בלבד
מנקה אולטראסוני, מחמם/טיימר מכני	קול-פארמר (ורנון הילס, אילינוי, ארה"ב)	EW-08895-23	סוניקטור אמבטיה - 0.5 גל, 115 V