כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.
1. הכנת תמיסת ליזופוספטידילכולין (LPC)
- ממיסים 25 מ"ג של אבקת LPC (ראה טבלת חומרים) עם 250 מיקרוליטר של תמיסה מעורבת של כלורופורם ומתנול (1:1) כדי ליצור תמיסת LPC של 10% ולהעביר אותה לצינור צנטריפוגה של 500 מיקרוליטר.
הערה: אם ה-LPC אינו מומס לחלוטין, הנח את צינור הצנטריפוגה בחומר ניקוי קולי ואולטרסאונד ב-40 קילו-הרץ למשך ~1 שעה כדי לקבל תמיסה אחידה.
- מחלקים את התמיסה ל-3 מיקרוליטר/שפופרת ושומרים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
הערה: ניתן לאחסן את הפתרון למשך ~2 שנים.
- לפני הניתוח, יש לדלל את התמיסה (שלב 1.2) ב-27 מיקרוליטר של תמיסת נתרן כלורי (NaCl) של 0.9%, ולשמור את התמיסה באמבט מים בטמפרטורה קבועה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
הערה: הכן את התמיסה ממש לפני תחילת ההזרקה.
2. הכנה כירורגית
- השתמש במחט של 32 גרם ו-2 אינץ' כדי להתחבר למזרק של 5 מיקרוליטר (ראה טבלת חומרים). ודא שמזרק המיקרוליטר אינו חסום. משוך 5 מיקרוליטר של תמיסת LPC להכנת ההזרקה.
- להרדים את העכבר בתא אינדוקציה המחובר למכשיר אידוי איזופלורן עם 3% איזופלורן מעורבב עם 100% חמצן בקצב של כ-0.3 ליטר לדקה.
- אשר את עומק ההרדמה על ידי היעדר רפלקס צביטה בבוהן בזמן שהנשימה חלקה.
- לגלח את ראש העכבר בין האוזניים באמצעות מכונת גילוח חשמלית. מרחו טיפות עיניים מסכות למניעת יובש בקרנית במהלך ההליך.
- לאחר מכן, מקם את העכבר במסגרת סטריאוטקסית (ראה טבלת חומרים) כשהצד הגבי כלפי מעלה, ואבטח את הראש עם חרוט אף ומהדק שיניים. שמור על הרדמה עם 1.2%-1.6% איזופלורן דרך האף.
הערה: ניתן לכוונן את ריכוז האיזופלורן בהתאם למצב הנשימה של העכברים.
3. הליך כירורגי
הערה: בעלי חיים מונחים על כרית חימום במהלך כל ההליכים.
- תקן את העכבר למנגנון הסטריאוטקסי עם מוטות אוזניים דו-צדדיים. ודא שמוטות האוזניים מפולסים והראש אופקי ויציב.
- יש לחטא את העור על הראש על ידי ניגובו מספר פעמים ביודופור, ואחריו אלכוהול בתנועה סיבובית. לאחר מכן, משתמשים באזמל כדי לחתוך חתך קטן של כ-1.5 ס"מ לאורך קו האמצע של הקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת.
- נגב את הגולגולת עם צמר גפן טבול במי חמצן 1% עד לחשיפת הברגמה, הלמבדה והפונטנל האחורי. הנח את המזרק על המנגנון הסטריאוטקסי.
הערה: השתמש במי חמצן בזהירות והימנע מלגעת ברקמות שמסביב.
- הקפידו על מיקום אופקי של ראש החיה (מלפנים ומאחור ושמאל וימין).
- כוונן את כפתור ציר ה-Z של המסגרת הסטריאוטקסית כך שקצה המחט והגולגולת פשוט ייגעו מבלי להתכופף, ולאחר מכן מדוד את קואורדינטת ציר ה-Z. בדוק את קואורדינטות Z של ברגמה ופונטנל אחורי.
- כוונן את מוט האוזן כך שההבדל בין קואורדינטות ה- Z של ברגמה לפונטנל האחורי לא יעלה על 0.02 מ"מ. לאחר מכן, עקוב אחר אותה שיטה כדי למדוד את קואורדינטות Z של המיקומים המתאימים בצד שמאל וימין של קו האמצע. כוונן את מוט האוזן כדי להבטיח שהשמאל והימין נמצאים באותה רמה.
- אתר את הקורפוס קלוסום. הגדר את מקור ה-XYZ ל-bregma.
הערה: אתר ההזרקה הראשון הוא 1.0 מ"מ לרוחב הברגמה, 2.4 מ"מ עומק ו-1.1 מ"מ קדמי. אתר ההזרקה השני הוא 1.0 מ"מ לרוחב הברגמה, עומק 2.1 מ"מ ו-0.6 מ"מ קדמי. לדוגמה, הקואורדינטות של הברגמה היא (0,0,0). מדוד את קואורדינטת Z של המיקום המתאים המסומן כ- (-1, 1.1, X) ו- (-1, 0.6, Y). ניתן לקבוע כי קואורדינטת אתר ההזרקה הראשונה של הקורפוס קלוסום היא (-1, 1.1, −[X + 2.4]), ואתר ההזרקה השני הוא (-1, 0.6, −[Y + 2.1]).
- לאחר קביעת אתר ההזרקה, סמן עם טוש סטרילי על הגולגולת ורשום את הקואורדינטות.
- קדחו בעדינות את האתר המסומן בעזרת מקדחת גולגולת (ראו טבלת חומרים). הקפד להימנע מדימום.
- הזיזו לאט את המחט לקואורדינטות הנתונות והתחילו בהזרקה. כדי לגרום לדמיאלינציה של קורפוס קלוסום, יש להזריק 2 מיקרוליטר של תמיסת LPC (שלב 1.2) בכל אתר הזרקה (שלב 3.5.) בקצב של 0.4 מיקרוליטר לדקה.
- לאחר ההזרקה, שמור את המחט בכל אתר למשך 10 דקות נוספות.
הערה: יש לוודא שהמרווח של שתי הזרקות הוא לא יותר מ-20 דקות.
- תפרו את העור בתפר 4-0 והמתינו עד שהחיה תתעורר תוך 10 דקות. מתן משככי כאבים לאחר הניתוח בהתאם לתקנות הטיפול בבעלי חיים במוסדות.
הערה: ניתן לקבוע את הזמן המומלץ להמתת חסד בהתאם למטרת הניסוי.