מידול דימום תוך חדרי בילודים באמצעות הזרקה תוך חדרית של המוגלובין

תקציר

מקור: Miller, B. A., et al. מידול דימום תוך חדרי בילודים באמצעות הזרקה תוך-חדרית של המוגלובין. J. Vis. Exp. (2022).

סרטון זה מדגים שיטה ליצירת מודל חולדה של דימום תוך חדרי בילודים. בהליך זה, גור חולדה מורדם מוזרק עם המוגלובין לחדר הצדדי של המוח. ההמוגלובין גורם לעקה חמצונית ומשחרר הם, המדמה דימום תוך חדרי. הנזק שנגרם לרקמות המוח, המונע על ידי מיני חמצן תגובתיים וציטוקינים דלקתיים, מוביל להגדלת החדר, תוצאה שכיחה של דימום תוך חדרי.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הכנת תמיסות המוגלובין ו-CSF

1. הכן תמיסה סטרילית של נוזל מוחי שדרה מלאכותי (aCSF) על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של תמיסת aCSF למיקרו-צינור של 1.5 מ"ל ואחסן על קרח.
2. הכינו תמיסת המוגלובין סטרילית של 150 מ"ג/מ"ל על ידי הוספת 75 מ"ג המוגלובין ל-500 מיקרוליטר של aCSF במיקרו-שפופרת של 1.5 מ"ל ואחסנו על קרח.

2. הכנת החיה להזרקה

1. סובב את כרית החימום להגדרה בינונית כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של החולדה.
2. להרדים חולדות ביום 4 לאחר הלידה (P4) בתא אינדוקציה מלא ב-3% איזופלורן.
   הערה: ודא הרדמה מספקת באמצעות תגובת צביטת הבוהן/זנב כל 15 דקות. עקוב אחר ההרדמה עם תצפית חזותית על צבע הרקמה, טמפרטורת הגוף וקצב הנשימה.
3. יש להקל על כאבים באמצעות זריקת קרפרופן תת עורית של 5 מ"ג/ק"ג לחולדה המורדמת.
4. הנח את החולדה המורדמת הנוטה במנגנון הסטריאוטקטי כשהאף ממוקם במתאם ההרדמה עם זרימה קבועה של 1.5% איזופלורן.
5. הדק את מוטות האוזניים שאינם קרועים על בשר השמיעה החיצוני כדי לאבטח את הראש.
   הערה: יש למרוח משחה וטרינרית כדי לשמור על לחות העיניים אם העיניים פקוחות בגיל ההזרקה.
6. נקו את הראש, לסירוגין עם אפליקטורים סטריליים עם קצה כותנה ספוגים בבטדין ואתנול 70%.
   1. געו באפליקטור הספוג בבטאדין במרכז הקרקפת ופזרו את הבטדין במעגלים, תוך תנועה כלפי חוץ.
   2. חזור על שלב 2.6.1.1 עם המוליך הספוג באתנול.
   3. חזור על שלב 2.6.1.1 ושלב 2.6.1.2 3x.
7. מרחו וילון כירורגי סטרילי כדי להגן על השדה הכירורגי.
8. בעזרת אזמל סטרילי, בצע חתך של 0.3 ס"מ אנכית במרכז הראש כדי לחשוף את ברגמה של הגולגולת.
   הערה: אם מזריקים מהלמבדה, חשפו את הלמבדה של הגולגולת במקום הברגמה.
9. השתמש באפליקטור סטרילי עם קצה כותנה כדי לייבש את האזור.

3. הגדרת המזרק הסטריאוטקטי

1. משוך את תמיסת ההמוגלובין שהוכנה בשלב 1.2 למזרק סטרילי של 0.3 מ"ל עם מחט 30G והנח את המזרק למערכת המזרק הסטריאוטקטית.
   הערה: אם נוצר תנאי בקרה, צייר תמיסת aCSF שהוכנה בשלב 1.1 למזרק סטרילי של 0.3 מ"ל והמשך בפרוטוקול.
2. הפעל את ממשק המזרק הסטריאוטקטי ולחץ על כפתור תצורה כדי להזין את הגדרות עוצמת הקול והקצב של ההזרקה.
   1. לחץ על נפח והגדר את עוצמת הקול ל-20,000 nL (20 μL).
   2. לחץ על קצב עירוי והגדר את הקצב ל-8,000 nL/min (8 μL/min).
3. צא מ- תצורה על ידי לחיצה על כפתור אפס את ה-Pos .
4. שטפו את קצה המחט על ידי לחיצה על כפתור Infuse עד שיופיע חרוז קטן של תמיסת המוגלובין בקצה המחט.
5. נדפו בעדינות את תמיסת ההמוגלובין מקצה המחט בעזרת אפליקטור סטרילי עם קצה כותנה.

4. הזרקת בעלי חיים

1. הגדר את bregma כ- אפס במערכת המזרק הסטריאוטקטית על ידי התאמת המיקום הבינוני והקדמי-אחורי של המזרק לפני הורדת קצה מחט המזרק הסמוקה כדי לגעת בעדינות בגולגולת בברגמה.
   הערה: אם מזריקים מהלמבדה, הגדירו את lambda כ- אפס.
2. זהה את הקואורדינטות הנבחרות.
   1. אם מזריקים מהברגמה, בחולדות P4 המתוארות כאן, השתמש ב- 1.5 מ"מ לרוחב, 0.4 מ"מ קדמי ו-2.0 מ"מ עומק מברגמה.
   2. אם מזריקים מהלמבדה, השתמשו בקואורדינטות הבאות עבור חולדות P4: 1.1 מ"מ לרוחב, 4.6 מ"מ קדמי ו-3.3 מ"מ עומק מהלמבדה.
3. הרם את מחט המזרק 1 ס"מ מעל הגולגולת כדי לנקות את הקרקפת. כאשר המזרק מורם, המשך להגדיר את הקואורדינטות הבינוניות והקדמיות.
4. הורד את מחט המזרק כדי לגעת בעדינות בגולגולת. בדוק שהמחט נוגעת בגולגולת.
5. הגדר את הקואורדינטות הדורסובנטרליות על פני תקופה של 30 שניות.
   הערה: בזמן קביעת הקואורדינטה הדורסובנטרלית, המחט תנקב את הגולגולת. יש להקפיד על כך שהמזרק יעבור דרך הגולגולת מבלי לעוות את הגולגולת. עיוות גולגולת נמנע על ידי משיכה איטית של המחט לאורך הקואורדינטה האחורית אם מתרחש עיוות, ואז הנחת המחט בחזרה באותו מסלול. זה מאפשר למחט לעבור דרך החור בגולגולת בפחות כוח וללא עיוות.
6. בממשק המזרק הסטריאוטקטי לחץ על כפתור הפעל כדי להתחיל בהזרקה.
7. לאחר סיום ההזרקה, השאר את מחט המזרק במקומה למשך 2 דקות כדי למזער את הזרימה החוזרת של התמיסה.
8. משוך את המזרק לאט לאורך הקואורדינטה האחורית במשך 2 דקות עד שקצה המחט נמצא 2 ס"מ מעל הקרקפת.
9. סובב את זרוע המזרק הסטריאוטקטית הרחק משדה הניתוח.

5. טיפול לאחר הניתוח

1. סגור את הקרקפת עם תפר מונופילמנט 6-0. בצע תפר קטוע אחד פשוט במרכז החתך של 0.3 ס"מ.
2. הסר את הגור מההרדמה והנח אותו על אזור מאובטח על כרית החימום.
3. החזירו את המכרסם לכלוב הביתי כדי להתאושש מההרדמה תחת השגחת הסכר שלו.
   הערה: חזרה בזמן לטיפול בסכר מפחיתה את התמותה המוקדמת לאחר הניתוח.
4. עקוב אחר בעלי החיים להרדמה על ידי אובדן רפלקס הימני מדי שעה לאחר הניתוח למשך 3 שעות.
5. עקוב אחר בעלי החיים מדי יום במשך 7 ימים לפעילות רגילה, צריכת מזון ועלייה במשקל. עקוב אחר אתר החתך לריפוי פצעים, סגירה והופעה מחודשת של פרווה באתר הניתוח.
   הערה: במקרה הנדיר שבו נצפים שינויים נוירולוגיים כגון התקפים, דיכאון מרכזי או ירידה בתיאבון במהלך הניטור, המתת חסד של בעל החיים באמצעות זלוף תוך-וסקולרי או פריקת צוואר הרחם בהרדמה.
6. כדי למנוע זיהום לאחר סגירת התפר והפצע מחלים, יש למרוח אנטיביוטיקה משולשת מקומית במקום החתך.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.3 מ"ל מזרק אינסולין	מזרק BD Microfine + אינסולין	230-4533	0.3-0.5 מ"ל סינרינגים יעבדו
1.5 מ"ל מיקרו-צינור	ארה"ב מדעית	1615-5500	פריט מס' K194642H -3 511
6-0 תפר מונופילמנט	אתיקון	667G
איזון אנליטי	מכשירי CCURIS	W3200-320
CSF מלאכותי (aCSF)	טוקריס ביוסיינס	3525	מספר אצווה: 72A
בטאדין	Purdue Products L.P.	301005-00	NDC 67618-150-09
קרפרופן (ניתן להזרקה)	זוטיס בע"מ	PI 4019448	רימדיל
אתנול	מעבדות דקון	2701
כרית חימום	קרן שמש	E12107-819	UL 612A, Z-1228-001
המוגלובין	חבר פרלמנט ביו-רפואי	100714	פריט SR02321
איזופלורן	טיפול נמרץ פיראמל	NDC 66794-017-25
וופורייזר איזופלורן	ווטקייפ	911103
אור להתקנה סטריאוטקטית	תעשיות דולן-ג'נר	Fiber-Lite MI-150
משאבת מזרק מיקרו-הזרקה	מכשירי דיוק עולמיים	MICRO21	184034 סידורי T08K
חמצן	Airgas Healthcare	UN1072	מספר פריט S1432080XA02
עכברושי ספראג דולי	מעבדות נהר צ'ארלס	קוד מתח: 001
כלי סטריאוטקטי	מוסדות KOPF	דגם 900LS לייזי סוזן
אפליקטור סטרילי עם קצה כותנה	Fischerbrand	23-400-118
להב כירורגי	covetrus	#10
אנטיביוטיקה משולשת מקומית	משחה אנטיביוטית משולשת	NDC 51672-2120-1