צביעה חיסונית של אינטרנוירונים בקטע היפוקמפוס של חולדה

תקציר

Swietek, B., et al., צביעה חיסונית של קטעים מלאים ומעובדים בביוציטין עבור סמנים נוירוכימיים. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים את תהליך ההדמיה של נוירון פנימי מלא ביוציטין בקטע היפוקמפוס של חולדה, ומדגיש את זהותו הנוירוכימית באמצעות שימוש בנוגדנים ספציפיים ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבחינת אתיקה של בעלי חיים.

1. צביעה של הנוגדן העיקרי והביוציטין

(יום 1)
הערה: הליך הצביעה החיסונית הבא מיועד לקטעים צפים חופשיים ודורש ניעור מתמשך במהירות נמוכה (2 סיבובים/דקה, סל"ד) על שייקר לכל שלבי הדגירה.

1. שטפו את הטישו 3 פעמים למשך 10 דקות כל אחת ב-0.1 M PBS (pH = 7.4).
   הערה: 0.1 מיליון PBS ניתן לרכישה מסחרית או לייצר במעבדה באופן הבא (מייצר 1 ליטר): 8 גרם NaCl, 0.2 גרם KCl, 1.44 גרם Na₂HPO₄, ו-0.24 גרם KH₂PO₄} ב-1 ליטר של dH₂O.
   הערה: אם הסמן הנוירוכימי הרצוי ידוע, ניתן לבצע צביעה של חלבון/פפטיד במקביל לצביעה של ביוציטין (שלבים 1.2 - 1.4). אם צובעים לביוציטין בלבד, המשך לשלב 1.5 .
2. אופציונלי: בלוק עם 10% סרום חוסם (BS; סרום עיזים רגיל (NGS) מדולל ב-0.3% Triton X-100 ב-PBS למשך שעה אחת ב-RT).
   הערה: כל באר צריכה לקבל את אותו נפח של הפתרון; הנפח המומלץ הוא בין 250 - 500 מיקרוליטר לבאר. בחירת הסרום החוסם מבוססת על המינים שבהם מגדלים את הנוגדנים המשניים ( למשל, NGS משמש לאנטי-עזים מצומדים בצבע (מיני נוגדנים ראשוניים בהתאמה)). אם מתעורר צורך להשתמש בנוגדנים משניים הגדלים במינים שונים למקטעים של צביעה חיסונית, כלול 10% מכל סרום תקין בשלב חסימה (2) ו-3% מכל סרום תקין עבור שלבי הדגירה הראשוניים והמשניים של נוגדנים.
3. (אופציונלי) דגרו את החלקים בנוגדנים ראשוניים, CB₁R (פוליקלונלי, שרקן), עם 0.3% טריטון X-100 ו-3% BS ב-0.1 מיליון PBS ב-RT O/N. CB₁R משמש לזיהוי ביטוי קולטן קנבינואידים מסוג 1.
   הערה: שלב זה הוא אופציונלי ואינו נדרש כדי לחשוף את מילוי הביוציטין. איור 2 מדגים קטע שמסומן עבור ביוציטין ו-CB₁R במהלך תהליך הצביעה הראשון. דגירה של O/N ב-RT מספיקה לרוב הנוגדנים הראשוניים; עם זאת, נוגדנים ראשוניים מסוימים, כולל CB₁R, דורשים 3 - 5 ימים של דגירה. אם הדגירה צריכה להיות ארוכה מ-1 ד', מומלץ לדגור ב-4 מעלות צלזיוס מכיוון שטריטון X-100 יכול לחלחל פרוסות ויכול להוביל להתפוררות הרקמה במהלך דגירה ממושכת בטמפרטורת החדר. כלול בקרה שלילית חסרת נוגדן ראשוני בקטע אחד לפחות עבור כל סדרת ניסויים כבקרה על הספציפיות של הנוגדן המשני. עבור בקרות שליליות, הנוגדן העיקרי מושמט, אך מתווספים 0.3% Triton X-100 ב-0.1 M PBS ו-BS.

(יום 2)

4. שטפו את חלקי המוח 3 פעמים למשך 10 דקות כל אחד ב-0.1 M PBS (pH = 7.4).
5. דגרו את החלקים במצומד צבע אדום סטרפטווידין (ריכוז: 1:1,000; עירור: 594 ננומטר עם פליטה בספקטרום האדום הנראה) עם 0.3% טריטון X-100 ו-3% BS ב-0.1 M PBS ב-4 מעלות צלזיוס O/N בחושך (עטוף בנייר אלומיניום) כדי לחשוף את הביוציטין. אופציונלי: כלול נוגדן משני, עז אנטי-שרקנים (ריכוז: 1:500; עירור: 488 ננומטר ופליטה בירוק), כאשר הדגירה לעיל לאחר הדגירה הראשונית האופציונלית בשלב 1.3.
   הערה: יהיה צורך בנוגדנים משניים רק אם מבוצע צביעת הנוגדן הראשוני האופציונלי (שלב 1.3). כדי להמחיש ביוציטין, מומלץ מצומד סטרפטווידין-פלואורופור עם ספקטרום פליטה באדום, מכיוון שהוא מסייע להמחיש אקסונים עדינים יותר בפירוט ובניגודיות טובה יותר (איורים 1 - 3).

(יום 3)

6. שטפו חלקי מוח 3 פעמים למשך 10 דקות כל אחד ב-0.1 M PBS (pH = 7.4).
7. כדי להגן על הקרינה ולהקל על צביעה מחדש בעתיד, הרכיבו את החלקים במדיום הרכבה על בסיס מימי ואטמו את שולי הכיסוי עם לק שקוף.
   הערה: עדיף לצבוע מחדש חלקים מוקדם ככל האפשר כדי למנוע קשיים בהסרת הלק מהמגלשה, התפשטות עובש והתייבשות רקמות עקב דליפת מדיום ההרכבה ממגלשת הזכוכית. ניתן למנוע זיהום מיקרוביאלי על ידי שימוש ב-0.02% נתרן אזיד ב-PBS.
   זהירות: נתרן אזיד רעיל מאוד ודליק כאשר הוא במגע עם מים. אנא עיין בנהלי הפעלה סטנדרטיים לטיפול וסילוק כימיקלים מסוכנים.
   (ימים 4 - 7)
8. בצע הדמיה קונפוקלית עם עירור ב-594 ו-488 ננומטר ובהגדלה של פי 20 או פי 40 כדי לחשוף נוירונים מלאים בביוציטין בסמנים אדומים ונוירוכימיים (CB₁R) בירוק. הערכת תיוג משותף (איור 2).
9. הגדר את חשיפת המצלמה לפחות מ-100 אלפיות השנייה כדי למנוע פוטו-הלבנה ולקבל ערימות תמונה קונפוקליות של הסורגים האקסונליים והדנדריטיים של הנוירונים כולם. השתמש בערימות תמונות קונפוקליות ובחבילות תוכנה למעקב אחר נוירונים כדי לשחזר את המורפולוגיה העצבית.

תוצאות

איור 1. מישור מוצע לתאים מתקרבים למילוי ביוציטין. התמונה ממחישה תא גרגיר (GC) מלא בביוציטין במהלך ההקלטה שעובד כדי לחשוף ביוציטין (באדום באמצעות סטרפטווידין מצומד 594). ל-GC יש את הדנדריטים שלו מכוונים במישור XY. שימו לב לאקסון תא הגרגיר המנותק (חץ ירוק) עקב תנועת פיפטה לאורך מישור ה-XY. שימו לב שאידיאלי להתקרב לנוירון זה לאורך מישור ה-XZ. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
NaCl	סיגמא	S7653	צביעה חיסונית
KCL	פלוקה	60129	צביעה חיסונית
דיסודיום מימן פוספט	סיגמא	S7907	צביעה חיסונית
מונופוטסיום פוספט	סיגמא	229806	צביעה חיסונית
טריטון X-100	סיגמא	T8787	צביעה חיסונית
שרקן ניסיונות אנטי CB1	סיגמא	Af530-1	צביעה חיסונית
Streptavidin, Alexa Fluor conjugate	בדיקות מולקולריות	S11227	צביעה חיסונית
סרום עיזים רגיל	סיגמא	G9023	צביעה חיסונית
וקטשילד	מעבדות וקטור	H-1000	צביעה חיסונית
נוגדנים משניים	בדיקות מולקולריות Invitogen	צבעים מצומדים של אלקסה פלואור	צביעה חיסונית
שייקר במהירות נמוכה של מסלול Labnet	ביואקספרס	S-2030-LS	צביעה חיסונית
מלקחיים	דומונט	11231-30	צביעה חיסונית
תיקיות שקופיות	EMS	71520	צביעה חיסונית
ביוציטין	סיגמא	B4261	אלקטרופיזיולוגיה