צביעה אימונוהיסטוכימית של חלבון S-100 בקטעי ביופסיית יניקה רקטלית אנושית

תקציר

מקור: Chi, S., Fang, et al. אבחון מחלת הירשפרונג על ידי ביופסיות יניקה רקטליות של צביעה חיסונית עבור קלרטינין, חלבון S100 ותוצר גן חלבון 9.5. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את הצביעה האימונוהיסטוכימית של חלבון S-100 בקטעי ביופסיה של יניקה רקטלית. חלקים שנאספו על ידי אנטיגן נחסמים ומטופלים בנוגדנים ראשוניים, ואחריהם נוגדנים משניים נגד S-100, סמן למחלת הירשפרונג. מצע כרומוגני מתווסף כדי לצבוע את התאים הממוקדים. הדגימות מיובשות ומורכבות לפני ההדמיה מתחת למיקרוסקופ.

פרוטוקול

1. הכנת ביופסיות היניקה של פי הטבעת (RSB) סעיפים

1. הנח את ביופסיות היניקה של פי הטבעת ב-4% פרפורמלדהיד למשך 6 שעות כדי לתקן את הרקמה. השתמש בנפח קיבוע פי 5 מנפח הרקמה.
2. יבש את הרקמה באמצעות מייבש הרקמות הפתולוגי למשך 11 שעות. כל התהליך המתוכנת מורכב מ-5 השלבים הבאים:
   1. מניחים את הרקמה בפורמלדהיד ומקבעים אותה למשך שעה.
   2. מניחים את הרקמה באתנול 75% למשך 4 שעות.
   3. מניחים את הרקמה באתנול מוחלט (שני שינויים, שעה כל אחד).
   4. מניחים את הרקמה באתנול מוחלט (שני שינויים, 30 דקות כל אחד).
   5. מניחים את הרקמה בקסילן (שלושה שינויים, שעה כל אחד).
3. מניחים את הרקמה בשעוות פרפין (58-60 מעלות צלזיוס) (שלושה שינויים, שעה כל אחד). הטמע את רקמות ה-RSB בגושי פרפין.
4. חתוך את גושי הפרפין באמצעות מיקרוטום עד שהרקמה נחשפת לחלוטין במישור חתך שלם.
5. חותכים את הבלוקים לקטעים של 0.4 מיקרומטר בעזרת מיקרוטום.
6. מניחים את החלקים במים של 45-50 מעלות צלזיוס למשך מספר שניות כל אחד כדי לאפשר לחלקים להתפשט לצלחת שטוחה.
7. העבירו את חלקי הפרפין לשקופיות.
8. אופים את השקופיות בתנור 60 מעלות למשך 3-5 שעות. הימנע מאפייה ארוכה מדי, מה שעלול להוביל לאובדן האנטיגנים.
9. הנח את השקופיות המפורקות לתוך קסילן (2 שינויים, 15 דקות כל אחד).
10. לחות את השקופיות באתנול מוחלט, 95%, 80% ואתנול 75% למשך 5 דקות כל אחת. לאחר מכן, שטפו אותם במים מטוהרים באוסמוזה הפוכה (RO) למשך 5 דקות נוספות.

2. אחזור אנטיגן

1. בצע דילולים עובדים לאחזור קלרטינין על ידי ערבוב של 4 מ"ל של מאגר אחזור אנטיגן של חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) עם 200 מ"ל מים מטוהרים RO. בצע דילולים עובדים עבור S100 ומוצר גן חלבון 9.5 (PGP9.5) על ידי ערבוב של 1 מ"ל של חומצת לימון נתרן ציטראט (100x) עם 99 מ"ל מים מטוהרים RO.
   הערה: ניתן לאחזר את הקלרטינין באופן מועדף על ידי פתרון אחזור EDTA. עם זאת, מאגר נתרן ציטראט חומצת לימון מתאים יותר לאחזור של S100 ו-PGP9.5.
2. מניחים את השקופיות בצנצנת מכתים קופלין. מלאו את הצנצנת בתמיסת שליפה והניחו אותה באמבט מים רותחים שחומם מראש. לאחר רתיחה של 20 דקות, הוציאו את הצנצנת מאמבט המים ותנו לה להתקרר לטמפרטורת החדר. תהליך הקירור אורך כ-10 דקות. הסר את השקופיות ושטוף אותן בעדינות פעם אחת עם מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS).
3. צייר עיגול עם עט טוש סביב הרקמה והכן קופסה רטובה להליכים הבאים.

3. חסימה

1. בצע דילול עבודה על ידי ערבוב של 3 מ"ל של 30% H₂O₂ עם 27 מ"ל מים מטוהרים RO.
2. זרוק שתיים או שלוש טיפות של תמיסה של 3% H₂O₂ טיפה על הרקמה כדי לחסום פרוקסידאזות. הוסף את הפתרון H₂O₂ באופן מיידי כדי להבטיח שהוא לא יגלוש מהעיגול. חסום פרוקסידאזות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
3. שוטפים את השקופיות בעדינות עם PBS (שלוש כביסות, 5 דקות כל אחת).
4. חסום את השקופיות למשך 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס עם אלבומין סרום בקר 5% (BSA, מוכן על ידי ערבוב של 1.5 גרם אבקת BSA עם 30 מ"ל מים מטוהרים RO).
   הערה: חסימה עם 3% מי חמצן יכולה למנוע 95% מהכתמים הלא ספציפיים וחסימה עם 5% BSA יכולה למנוע את 5% האחרים של צביעה לא ספציפית. שלב את שתי השיטות לקבלת תוצאה אמינה.

4. תגובת אנטיגן-נוגדנים

1. הסר את ה-5% BSA והוסף 50 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני (קלרטינין, S100 או PGP9.5) לשקופית. דגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
2. שטפו את השקופית עם PBS (שלוש פעמים, 3 דקות כל אחת).
3. הוסף 50 מיקרוליטר של משפר פולימר (מגיב A; ראה טבלת חומרים) לקטע ודגר אותו למשך 20 דקות בחממה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את השקופית עם PBS (שלוש פעמים, 3 דקות כל אחת).
4. הוסף 50 מיקרוליטר של נוגדן משני B (נוגדן משני נגד ארנב/עכבר עז) לקטע ודגירה למשך 30 דקות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. שוטפים את הקטע עם PBS (שלוש פעמים, 5 דקות כל אחת).

5. 3,3-דיאמינובנזידין והמטוקסילין צביעה

1. הוסף 850 מיקרוליטר של מים מטוהרים RO לצינור של 1.5 מ"ל והוסף את ריאגנטים לצביעה (ראה טבלת חומרים) בסדר A, B ו-C. הוסף 50 מיקרוליטר מכל מגיב כדי לקבל סך של 1 מ"ל של תמיסת עבודה של 3,3-דיאמינובנזידין (DAB). אם יש משקעים, השתמש בתמיסה לאחר הסינון.
2. הוסף טיפה של תמיסת עבודה DAB לחלק הרקמה וצבוע למשך 3-10 דקות. דגרו את השקופיות ב-DAB בטמפרטורת החדר עד לזיהוי כתמים חומים. עקוב בזהירות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר. הרחק את פתרון העבודה של DAB מאור. לאחר מכן, שטפו את השקופית עם PBS למשך 5 דקות.
3. הוסף טיפת המטוקסילין כדי להכתים את הגרעינים למשך כדקה אחת. לאחר מכן, החזיקו את צנצנת הקופלין ושטפו אותה תחת טפטוף מים למשך כ-30-40 שניות עד להסרת עודפי הצבע. היזהר לא לפגוע בקטעי הרקמות.
4. טבלו את שקופיות ה-RSB בצנצנת קופלין המכילה PBS למשך 25-30 שניות. לאחר מכן, התמיינו ב-1% חומצה הידרוכלורית-אתנול למשך 10 שניות. שטפו את השקופיות עם PBS למשך דקה אחת.
5. ייבשו את המגלשות בסדר הפוך של הידרציה: 75%, 80%, 95% ואתנול מוחלט (5 דקות כל אחת).
6. חשוף את השקופיות לקסילן (2 שינויים, 5 דקות כל אחד).
7. התקן את הכיסוי באמצעות הרכבה אולטרה-נקייה. הניחו לשקופיות להתייבש לפני ההדמיה באמצעות מיקרוסקופ.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נוגדן קלרטינין	MXB ביוטכנולוגיות	MAB-0716 170416405c	נוגדן: נוגדן ראשוני
נוגדן S-100	MXB ביוטכנולוגיות	Kit-0007	נוגדן: נוגדן ראשוני
נוגדן PGP9.5	שנחאי לונג איילנד נוגדנים ושות 'בע"מ	R-0457-03	נוגדן: נוגדן ראשוני
מגיב משפר	MXB ביוטכנולוגיות	KIT-9902-A 170416405a	נוגדן: נוגדן משני A
נוגדן משני IgG נגד ארנב/עכבר עיזים	MXB ביוטכנולוגיות	KIT-9902-B	נוגדן: נוגדן משני B
ערכת צביעה DAB (מכילה מגיב A, B ו-C)	MXB ביוטכנולוגיות	DAB-0031	ערכת צביעה
חממת חום	שנחאי yiheng מכשיר ושות 'בע"מ	DHP-9082	מכשיר
מערכת ביופסיה רקטלית יניקה Rbi2	Aus Systems Pty Ltd, דרום אוסטרליה, אוסטרליה	CP1200 HP1000 SS1000	מכשיר
מיקרוטום	לייקה	leica RM2016	מכשיר
חומצת לימון נתרן ציטראט בופר(100X)	MXB ביוטכנולוגיות	MVS-0101	מאגר אחזור אנטיגן
מייבש רקמות פתולוגי	ווהאן ג'ונג'י אלקטרונית ושות' בע"מ	JT-12F	מכשיר