כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.
1. הכנת תמיסות דיסקציה ונוזל מוחי מלאכותי
- מים קרבוגנאט אולטרה-טהורים (שהם מים מסוננים בהתנגדות של 18.2 MΩ·cm) עם קרבוגן (95% O2/5% CO2) למשך 5 דקות באמצעות מפזרי בועות אבן אוויר (מאווררים לאקווריומים).
הערה: ניתן לחבר אבני אוויר לווסת של מיכל הקרבוגן באמצעות צינורות סיליקון סטנדרטיים . אם אבני אוויר אינן זמינות, אטום סגור את קצה צינור הסיליקון ותקע חורים קטנים באיטום כדי לאפשר לגז הקרבוגן לבעבע החוצה ולקרבוגן את התמיסה.
- הכינו תמיסת חיתוך על ידי המסת המומסים מ-טבלה 1 במים טהורים במיוחד. הוסף CaCl2 לתמיסה שעברה קרבוגן במשך 5 דקות לפחות כדי לעזור לה להתמוסס.
הערה: לחלופין, יש להוסיף את CaCl2 תחילה, כך שהוא יוכל להתמוסס בקלות בתמיסה בלתי רוויה. התמיסה, בצורה נוזלית, צריכה להיות 300 - 320 mOsm/L ובעלת pH של 7.4 לאחר רוויה בקרבוגן.
- מצננים את תמיסת החיתוך ל-0 - 4 מעלות צלזיוס. השאירו את התמיסה במקרר למשך הלילה או הכניסו את התמיסה למקפיא למשך שעה אחת ועקבו באופן רציף אחר הטמפרטורה.
הערה: ניתן לאחסן את פתרון הדיסקציה עד 3 לילות; השליכו לאחר מכן.
- קרבוגנציה של תמיסת החיתוך למשך 5 - 10 דקות לפני השימוש.
הערה: באופן אידיאלי, הפתרון צריך להופיע כרפש או לעבור לרפש לפני השימוש.
- הכינו נוזל מוחי מלאכותי של מכרסמים (ACSF) על ידי המסת המומסים מ-טבלה 2 במים טהורים במיוחד. קרבוגנציה של תמיסת ה-ACSF כשהיא באמבט מים המחומם ל-35 מעלות צלזיוס עד לשימוש. הוסף CaCl2 לתמיסה שעברה קרבוגן במשך 5 דקות לפחות כדי לעזור לה להתמוסס.
הערה: לחלופין, הוסף תחילה את CaCl2 כדי שיוכל להתמוסס בקלות בתמיסה בלתי רוויה. התמיסה, בצורה נוזלית, צריכה להיות 290 - 320 mOsm/L ובעלת pH של 7.4 לאחר רוויה בקרבוגן. יש לבצע פתרונות בנפחים של 1, 2 או 4 ליטר בהתאם למשך הניסויים. הכינו 4 ליטר ליום שלם (8 שעות) של ניסויים. יש להכין את ה-ACSF טרי מדי יום; אין לאחסן אותו ליותר מ-1 ד.
2. נתיחת עכבר לאיסוף רקמת מוח
- אסוף את כל הכלים והחומרים הדרושים לנתיחת בעלי חיים. הגדר את סביבת העבודה כדי להתכונן לנתיחות של בעלי חיים.
- בדוק את מיכל הקרבוגן (95%O2/5%CO2) כדי לוודא שהוא אינו ריק. החלף את בלון הגז לפני הניסויים אם נותר פחות מ-500 psi של לחץ.
- כייל את הוויברטום (פורס רקמות להב רוטט) בהתאם למדריך ההוראות של היצרן. כוונן את הגדרת הרטט כך שתהיה משרעת חיתוך של 1 מ"מ ומהירות חיתוך של 0.12 מ"מ לשנייה.
הערה: ההגדרות האופטימליות עשויות להיות שונות עבור כל חותך להב רקמות רוטט; עם זאת, באופן כללי, המשרעת צריכה להיות גבוהה ומהירות החיתוך צריכה להיות נמוכה.
- מלאו את תא הדגירה של פרוסות המוח (, כלומר , שומר פרוסות המוח) ב-ACSF ובעבעו אותו בקרבוגן. לאחר מכן הניחו את תא הדגירה באמבט מים המוגדר ל-35 מעלות צלזיוס.
- קחו עכבר צעיר משני המינים, בין הגילאים 13 יום (עמ' 13) עד 21 יום (עמ' 21, כאשר p0 הוא תאריך הלידה).
- להרדים את העכבר באמצעות הזרקה תוך-צפקית של נתרן פנטוברביטל (55 מ"ג/ק"ג משקל גוף). לאחר שהעכבר מורדם עמוק, כפי שמעיד היעדר רפלקס צביטת הבוהן, השתמש מיד במכשיר גיליוטינה שאושר על ידי הווטרינר כדי לערוף את ראשו של העכבר בתנועה מהירה אחת.
הערה: הכן את הזרקת הנתרן פנטוברביטל בהתאם לנהלים המומלצים על ידי הנחיות המוסד.
- החזיקו את אפו של העכבר כדי לייצב את הראש הכרות ובצעו בעדינות חתך בקו האמצע, החל מבין עיני העכבר ולכל אורך הקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת. ודא שהגולגולת אינה דחוסה על ידי הלחץ המופעל על ידי סכין הגילוח. השתמש בפינת קצה סכין הגילוח כדי להגביר את דיוק החיתוך.
- פזרו את דשי הקרקפת של העכבר בעזרת האצבעות כדי לחשוף את הגולגולת. לאחר מכן, השתמש בפינה הטרייה של קצה סכין הגילוח כדי לבצע חתך לאורך קו האמצע של הגולגולת; שימו לב היטב כדי להימנע מכל מגע עם קליפת המוח.
- הכנס מלקחיים רסיסים לארובות העיניים של העכבר כדי לייצב את הראש הכרות והנח אותו בצלחת פטרי מלאה בתמיסת חיתוך קרה (0 - 4 מעלות צלזיוס). ודא שהראש שקוע במלואו בתמיסת החיתוך.
- השתמש בסט שני של מלקחיים רסיסים כדי לקלף בעדינות את קרקפת העכבר, להסיר את עצם האף על ידי קילוף שלה ולהסיר את החלק האחורי (הצד הזנבי) של הגולגולת.
הערה: עצם האף של עכברים צעירים רכה מאוד ונשברת בקלות.
- השתמש במיקרו מרית כדי לחתוך את עצבי הראייה, העצבים הטריגמינליים וחוט השדרה. לאחר מכן, השתמשו במיקרו מרית כדי להפריד בעדינות את המוח מהגולגולת. השאירו את המוח שקוע לחלוטין בצלחת פטרי מלאה בתמיסת דיסקציה.
3. הכנת פרוסות קליפת המוח מקליפת המוח הסומטוסנסורית-מוטורית
- מלאו את מגש החיץ של הוויברטומה ב~150 מ"ל של תמיסת חיתוך קרה (0 - 4 מעלות צלזיוס).
הערה: לחלופין, שמור את מגש החיץ במקפיא עד הצורך כדי לשמור על טמפרטורה נמוכה במהלך הליך החיתוך.
- הדביקו את רקמת המוח מהעכבר על שלב הוויברטום (מחזיק דגימה/מגש) באמצעות דבק דבק מיידי. עבור עכברים, חתכו חלק זנב קטן במוח (כלומר., המוח הקטן) כך שניתן יהיה להדביק אותו בקלות על מחזיק הדגימה (מה שמאפשר לצד הרוסטרלי של המוח לפנות לתקרה).
הערה: לחלופין, ניתן להכין פרוסות מוח אופקיות של עכבר על ידי הדבקת הצד הגבי של המוח על מחזיק הדגימה (הצד הגחוני של המוח צריך לפנות לתקרה).
- הנח בעדינות את מחזיק הדגימה (עם רקמת המוח) לתוך מגש החיץ. ודא שהחלק הגבי של המוח פונה ללהב הוויברטום.
הערה: זה קריטי למזער את משך הזמן שהמוח נחשף לאוויר.
4. חתך ואיסוף רקמות מוח
- פורסים את המוח לפרוסות בעובי 450 מיקרומטר באמצעות הוויברטום בכיוון הגב לגחון. ודא שהמוח נשאר מעוגן לחלוטין למגש הדגימה בזמן חיתוך.
- בצע את החיתוך הראשון במוח העכבר כדי להסיר את נורת הריח. לאחר מכן, בצע חתכים לאחר מכן עד שנצפה האזור הסומטוסנסורי-מוטורי (ממוקם בערך באמצע הדרך בין נורת הריח לברגמה).
הערה: לחלופין, חתכו את המוח לפרוסות דקות יותר (200 מיקרומטר) עד שהקורפוס קלוסום מופיע במבט העטרתי של המוח, מה שמצביע על כך שהאזור הסומטוסנסורי-מוטורי קרוב.
- השתמש בפיפטה העברה רחבה כדי לאסוף פרוסות קורונליות (450 מיקרומטר) המכילות את האזור הסומטוסנסורי-מוטורי ולהטביע אותן בצלחת פטרי המכילה תמיסת דיסקציה קרה (0 - 4 מעלות צלזיוס).
- השתמש בסכין גילוח חדש וחתך את כל הרקמות העודפות מהפרוסות. עבור פרוסות עטרה מעכברים, בצע חיתוך רוחבי ממש מתחת לקומיסורה הניאו-קורטיקלית ( כלומר, קורפוס קלוסום). אין לחתוך בתנועת ניסור; כל שעליך לעשות הוא להפעיל לחץ על הלהב לתוך הרקמה ולהשתמש במברשת פירוט כדי להפריד בעדינות את הרקמה. הקפד למזער את תנועת פרוסת העטרה.
- השתמש בפיפטה בעלת קדח רחב כדי להעביר את החלק הגבי של פרוסות העטרה המכילות את הניאו-קורטקס (שכבה 1 - 6) לצלחת פטרי שנייה מלאה ב-ACSF חם (35 מעלות צלזיוס) לרגע (~1 שניות). לאחר מכן, העבירו מיד את הפרוסות לתא דגירה המכיל ACSF קרבוגן חם (35 מעלות צלזיוס).
הערה: מטרת ההעברה לצלחת פטרי עם ACSF היא למזער את העברת תמיסת החיתוך לתא הדגירה תוך העברת פרוסות מוח עם הפיפטה רחבת הקדח. השתמש בבארות המרובות של תא הדגירה כדי לשמור על פרוסות מוח שונות מאורגנות.
- השליכו את שאר המוח ופגר בעלי החיים בהתאם להנחיות המוסדיות.
5. דגירה ותחזוקה
- השאירו את פרוסות המוח שקועות מעט בתא הדגירה בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, הסר את תא הדגירה מאמבט המים ואפשר לו לחזור לטמפרטורת החדר (20 - 25 מעלות צלזיוס). המתן שעה אחת עד שפרוסות המוח יתאוששו לפני ביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות.
הערה: ודאו שאין בועות אוויר שנאספות מתחת לפרוסות המוח בתא הדגירה. בועות אוויר הן ממשקי אוויר הגורמים לנזק לרקמות. ניתן לשמור על פרוסות המוח של העכבר למשך 6 - 8 שעות בתא דגירה קרבוגן היטב עם ACSF.
6. רישומים אלקטרופיזיולוגיים של שכבת קליפת המוח השטחית
הערה: אירועי Ictal נצפים בהקלטות פוטנציאל השדה המקומי החוץ-תאי (LFP) מפרוסות מוח. ניתן לצפות ולתעד את ה-LFP של פרוסת המוח באמצעות תא מסוג ממשק או מערכת מערך רב-אלקטרודות שקוע (MEA).
- השתמש בפיפטה העברה רחבה או במברשת פירוט כדי להעביר פרוסת מוח על נייר עדשה חתוך מראש מעט גדול יותר המוחזק במקומו באמצעות פינצטה דנטלית. העבירו את נייר העדשה (שעליו מונחת פרוסת המוח) לתא ההקלטה ואבטחו אותו במקומו באמצעות מסך נבל.
- יש לרוץ חם (35 מעלות צלזיוס), ACSF קרבוגן מחלחל דרך תא ההקלטה מעל פרוסת המוח בקצב של 3 מ"ל לדקה (~1 טפטוף לשנייה). השתמש במדחום דיגיטלי כדי לוודא שתא ההקלטה הוא 33 - 36 מעלות צלזיוס.
- משוך אלקטרודות זכוכית עם עכבה של 1 - 3 MΩ מצינורות זכוכית בורוסיליקט (בקוטר חיצוני של 1.5 מ"מ) באמצעות מושך. מלאו מחדש את אלקטרודות הזכוכית ב-ACSF (~10 מיקרוליטר) באמצעות מזרק המילטון. השלך מיד את האלקטרודה אם הקצה פגום.
הערה: הלבינו את חוט הכסף (5 דקות) ואפשרו רק לחלק מינימלי (כלומר, , הקצה) של חוט הכסף להיות שקוע באלקטרודות הזכוכית הממולאות מאחור של ACSF כדי למזער רעש וסחף במהלך ההקלטות. הסר את כל עודפי ה-ACSF מאלקטרודת הזכוכית בעזרת מזרק המילטון במידת הצורך.
- השתמש במיקרוסקופ סטריאו 20X כדי להנחות במדויק את אלקטרודת זכוכית ההקלטה לשכבת קליפת המוח השטחית (2/3) באמצעות מניפולטורים ידניים. הקלט/הצג את הפעילות החשמלית של פרוסת המוח במחשב עם תוכנה סטנדרטית.
הערה: פרוסות מוח ברות קיימא (איכותיות) יציגו פוטנציאל מעורר חזק בתגובה לגירויים חשמליים מופעלים (100 מיקרון, 30 - 300 מיקרו-A) או פולסי אור (30 אלפיות השנייה, 10 mW/mm2) עבור רקמה אופטוגנטית.
7. אינדוקציה של פעילויות דמויות התקף
- יש להחדיר ACSF המכיל 100 מיקרומטר 4-אמינופירימידין (4-AP) מעל פרוסת המוח. ממיסים 80 מ"ג של 4-AP ב-8.5 מ"ל מים כדי ליצור תמיסת מלאי של 100 מ"מ 4-AP. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת מלאי של 100 מ"מ 4-AP ל-100 מ"ל של ACSF כדי להשיג פרפוזה ACSF עם 100 מיקרומטר 4-AP.
הערה: לחלופין, השתמש ב-Zero-Mg2+ ACSF (טבלה 3), תמיסת ACSF מותאמת ללא תוספת Mg2+, כדי לחלחל את פרוסת המוח. הזמן הממוצע להופעת אירועי ictal הוא 15 דקות; עם זאת, ייתכן שיידרשו עד 40 דקות עבור חלק מפרוסות המוח.
8. יצירת התקפים לפי דרישה: אסטרטגיה אופטוגנטית לעכברים אופטוגנטיים
- הפעל פולס קצר (30 אלפיות השנייה) של אור כחול (470 ננומטר) (עם עוצמת פלט מינימלית של 1 mW/mm2) כדי ליזום אירוע ictal. השתמש במניפולטור ידני כדי למקם סיב אופטי בקוטר ליבה של 1,000 מיקרומטר (0.39 NA) ישירות מעל אזור ההקלטה.
הערה: הגדר את קצב גירוי הפוטו כך שיתאים לקצב הרצוי של התרחשות האירוע האיקטלי (, כלומר, פעימה אחת כל 50 שניות). עם זאת, לא ניתן להגזים בקצב מהקצב הפנימי שבו מתרחשים אירועים איקטליים.
טבלה 1: מתכון לפתרון נתיחה. אלה הוראות להכנת כרכים של 1 ליטר או 2 ליטר. MW = המשקל המולקולרי של המומס.
| # | מגיב | Conc. [mM] | MW (g/mol) | 1L (g) | 2L (g) |
| 1 | סוכרוז | 248 | 342.3 | 84.89 | 169.78 |
| 2 | נתרן ביקרבונט (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 2.18 | 4.37 |
| 3 | דקסטרוז (D-גלוקוז) | 10 | 180.16 | 1.8 | 3.6 |
| 4 | אשלגן כלורי (KCl) | 2 | 74.55 | 0.15 | 0.3 |
| 5 | מגנזיום גופרתי (MgSO4·7H2O) | 3 | 246.47 | 0.74 | 1.48 |
| 6 | נתרן פוספט מונו-בסיסי מונוהידראט (H2NaPO4·H2O) | 1.25 | 137.99 | 0.17 | 0.34 |
| 7 | סידן כלורי (CaCl2·2H2O) | 1 | 147.01 | 0.15 | 0.29 |
טבלה 2: מתכון לנוזל עמוד שדרה מוחי מלאכותי של מכרסמים (ACSF). אלה הוראות ליצירת כרכים של 2 ליטר או 4 ליטר. MW = המשקל המולקולרי של המומס.
| # | מגיב | Conc. [mM] | MW (g/mol) | 2L (g) | 4L (g) |
| 1 | נתרן כלורי (NaCl) | 123 | 58.4 | 14.37 | 28.73 |
| 2 | נתרן ביקרבונט (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 4.37 | 8.74 |
| 3 | דקסטרוז (D-גלוקוז) | 10 | 180.16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | אשלגן כלורי (KCl) | 4 | 74.55 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | מגנזיום גופרתי (MgSO4·H2O) | 1.3 | 246.47 | 0.64 | 1.28 |
| 6 | נתרן פוספט מונו-בסיסי מונוהידראט (HNaPO4·H2O) | 1.2 | 137.99 | 0.33 | 0.66 |
| 7 | סידן כלורי (CaCl2·2H2O) | 1.5 | 147.01 | 0.44 | 0.88 |
טבלה 3: מתכון לאפס-מ"ג2+ נוזל שדרה מוחי מלאכותי של מכרסמים (אפס-מ"ג2+ ACSF). אלה הוראות ליצירת כרכים של 2 ליטר או 4 ליטר. MW = המשקל המולקולרי של המומס.
| # | מגיב | Conc. [mM] | MW (g/mol) | 2L (g) | 4L (g) |
| 1 | נתרן כלורי (NaCl) | 123 | 58.4 | 14.37 | 28.73 |
| 2 | נתרן ביקרבונט (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 4.37 | 8.74 |
| 3 | דקסטרוז (D-גלוקוז) | 10 | 180.16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | אשלגן כלורי (KCl) | 4 | 74.55 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | מגנזיום גופרתי (MgSO4·H2O) | חופשי נומינלית | 246.47 | 0 | 0 |
| 6 | נתרן פוספט מונו-בסיסי מונוהידראט (HNaPO4·H2O) | 1.2 | 137.99 | 0.33 | 0.66 |
| 7 | סידן כלורי (CaCl2·2H2O) | 1.5 | 147.01 | 0.29 | 0.59 |
