הקמת מודל התקף אפילפטי המושרה על ידי Pentylenetetrazole בעכברים

תקציר

מקור: Shimada, T., et al. Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים את תהליך השראת האפילפסיה בעכברים באמצעות זריקות פנטילנטטראזול (PTZ), אנטגוניסט לקולטן GABA-A. מתן תוך-צפקי חוזר של PTZ מוריד בהדרגה את סף ההתקפים על ידי עיכוב זרם יוני כלוריד, שיבוש הולכה עצבית מעכבת ומוביל לריגוש יתר בתאי עצב המעוררים התקפים. תהליך זה מביא להתלקחות והתפתחות של התקפים ספונטניים, המדמים אפילפסיה כרונית.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הכנה של Pentylenetetrazole (PTZ)

1. ממיסים 2 מ"ג/מ"ל PTZ ב-NaCl סטרילי של 0.9% (w/v). הכן PTZ ביום השימוש.

2. הזרקת PTZ

1. בצע את כל הניסויים בין השעות 9:00 בבוקר ל-12:00 בצהריים.
2. מדוד את משקל הגוף של החיה.
3. הנח את החיה בתא תצפית להתרגלות.
4. במהלך תקופת ההרגלה (3 דקות), חשב את נפח תמיסת ה- PTZ להזרקה על סמך משקל גופו של בעל החיים ומינון ההזרקה שנקבע בעבר.
   הערה: לדוגמה, כאשר משתמשים ב-35 מ"ג/ק"ג PTZ, נדרש 0.875 מ"ג PTZ לעכבר במשקל 25 גרם (35 מ"ג/ק"ג x 0.025 ק"ג = 0.875 מ"ג). לכן, יש להזריק 437.5 מיקרוליטר של תמיסת PTZ של 2 מ"ג/מ"ל (0.875 מ"ג / 2 מ"ג/מ"ל = 0.4375 מ"ל). מינון ההזרקה של PTZ תלוי בגנוטיפ ובזן של העכבר. עבור עכברי C57BL/6 מסוג בר, מומלץ מינון של 30-35 מ"ג PTZ/ק"ג משקל גוף לניסוי הראשון. הרגישות ל-PTZ תלויה בזן העכבר בו נעשה שימוש. מינון ההזרקה משתנה בהתאם למטרת הניסוי.
5. הזריק PTZ תוך צפקי עם מזרק של 1 מ"ל המחובר למחט בגודל 27 לרבע השמאלי או הימני של בטן החיה. הימנע מהזרקה בקו האמצע.
   1. הימנע מזריקות חוזרות ונשנות באותה תנוחה.
6. התבוננו בהתנהגויות של בעלי חיים במשך 30 דקות לאחר מתן PTZ (Figure 1A) וסווגו את ההתנהגות החריגה וציינו אותה כפי שמוצג להלן. במידת האפשר, החזיקו את בעלי החיים תחת השגחה למשך 24 שעות, או לפחות 6-10 שעות נוספות לאחר ההזרקה, במיוחד לאחר שציון חומרת ההתקף מגיע ל-3 ומעלה.
   1. שימו לב לכל התקפים קלים או שינויים התנהגותיים בבעלי החיים מעבר לתקופת התצפית של 30 דקות. תקופת תצפית ממושכת זו עשויה לטפל בהשפעה חשובה ומלאה במיוחד של מינון תת-פרכוסי של PTZ ביצירת התקפים כרוניים ללא התגרות באפילפסיה.
   2. בנוסף, מדוד את משך ההתקף של כל התקף שנצפה מכיוון ששינויים במשך ההתקף קשורים לחומרת ההתקף. יתר על כן, ההשהיה להתקף הראשון לאחר הזרקת ה-PTZ היא אמצעי חשוב נוסף שיש לאסוף. ניטור תדירות, משך וחביון ההתקפים הוא קריטי לכל מחקר מולקולרי לאחר ההתקף.
7. הזרקת PTZ כל יומיים (איור 1A). מספר הזריקות תלוי במטרת הניסוי. דוגמאות מייצגות הן כדלקמן.
   1. כדי ליצור בעלי חיים מוארים לחלוטין, ברגע שבעל חיים חווה התקף בציון 5 (התקף טוני-קלוני), יש לסיים את ההזרקה תוך שלושה טיפולים נוספים. במקרה זה, הגדל את מינון ההזרקה אם ציון ההתקף אינו עולה במשך שלושה טיפולים רצופים. כל בעל חיים יכול לקבל מספר ומינון שונה של זריקות PTZ.
   2. קבע את המספר והמינון של זריקת PTZ בכל מצב כדי להעריך את הפגיעות ל-PTZ, כולל בהערכות של תרופות נגד אפילפסיה ומחקרים על הפנוטיפ של עכברים מהונדסים גנטית. תן לכל בעלי החיים את אותו מספר זריקות PTZ; מומלץ בסך הכל 8 עד 12 זריקות. אם בעל חיים מת, יש לציין את ציון ההתקף כ-6.
   3. קבע את מינון ההזרקה הדרוש לשמירה על ציון התקפים גבוה (4 או 5) עבור 10 זריקות או יותר כדי לחקור את השינויים ההיסטופתולוגיים המתרחשים בהתקפים אפילפטיים. במקרה זה, מספר ההזרקה הכולל צריך לנוע בין 25 ל-30. הפחת את מינון ההזרקה אם ציון ההתקף מגיע ל-5. אם ציון ההתקף יורד ל-3 או פחות, הגדל את מינון ההזרקה.

תוצאות

איור 1: תיאור קצר של הפרוטוקול. (א) איור סכמטי של הדלקה בתיווך PTZ. (B) איורים של התנהגויות מייצגות של בעלי חיים עבור ציוני ההתקפים בהתאמה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Pentylenetetrazole	סיגמא-אולדריץ'	P6500
נתרן כלורי	MANAC	7647-14-5
עכבר	CLEA יפן		C57Bl/6NJcl, לאחר הלידה 8 שבועות, זכר
מזרק (1mL)	Terumo	SS-01T
מחט (27 גרם x 3/4 אינץ') (0.40 x 19 מ"מ)	Terumo	NN-2719S
משקל שקילה	מטלר	PE2000	פריט זה הוא מוצר שהופסק. כמעט שווה ערך ל-FX-2000i עם FXi-12-JA מחברת A&D.