כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.
1. הכן מזרק להזרקה
- ממיסים ליזולציטין בתמיסה של 1% בתמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS; pH 7.4) ומאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס בכמויות קטנות (75 מיקרוליטר). להפשיר בקבוקון לטמפרטורת החדר (RT).
הערה: אם הליזולציטין אינו מומס, סוניקציה של הצינור בחומר ניקוי קולי (40 קילו-הרץ) למשך כ-30 דקות ליצירת תמיסה אחידה.
- טפל בנימי הזכוכית שנמשכו מראש בזהירות רבה כדי למנוע נזק לקצה העדין. הברג את האום של מזרק הזרקה של 10 מיקרוליטר והשחיל אותו על הקצה השטוח של הנימים, ואחריו שתי טבעות, וודא שקצוות ההזדווגות של הטבעות מיושרים והנימים צמודים בטבעת החרוטית (איור 1). שוטפים את המזרק באלכוהול איזופרופיל ומסירים את הבוכנה. לאחר הייבוש, הברג את מכלול המחט ביד בחוזקה על מזרק ההזרקה.
- חבר את מחט רכזת המתכת למזרק ההתחלה. חודרים דיסק גומי עם המחט ומחליקים אותו למטה לבסיס. מלאו את מזרק ההתחלה בליזולציטין. לחץ בעדינות על מזרק ההתחלה עד שנראה נוזל בקצה המחט. זה מבטיח שבועות אוויר לא יוכנסו למזרק ההזרקה.
- הכנס את מחט רכזת המתכת של מזרק ההתחלה למזרק ההזרקה. בצע אטימה יציבה עם דיסק הגומי, לחץ לאט על מזרק ההתחלה עד שהנימים ממלאים את הקצה בתמיסה. הסר בזהירות את מזרק ההתחלה תוך לחיצה בו זמנית כדי למלא את קנה המזרק המזריק מבלי להכניס בועות אוויר. הכנס את הבוכנה למזרק ההזרקה וודא שהתמיסה זורמת מקצה הנימים כשהבוכנה נלחצת בעדינות.
הערה: אם נראות בועות אוויר כלשהן במזרק הנימים או בהזרקה, יש לחזור על הכנת המזרק מההתחלה. נוזל רציף במנגנון ההזרקה הוא קריטי כדי להבטיח נפחי הזרקה מדויקים.
- חבר את מזרק ההזרקה שהושלם לזרועו של מיקרומניפולטור סטריאוטקטי. המכשיר המושלם הזה יוכל להזריק 15-20 בעלי חיים לפני שיהיה צורך למלא אותו מחדש.
- השלך את הליזולציטין הנותר ממזרק ההתחלה. משוך ולחץ אלכוהול איזופרופיל מספר פעמים, ונתק את מחט רכזת המתכת. המתן מספר שעות עד שאלכוהול האיזופרופיל שנותר במזרק ההתחלה יתאדה לפני המילוי שוב.
2. הכינו את החיה להליך כירורגי
הערה: הליך זה מתואר עבור נקבות עכברי C57BL/6 בגילאי 8-10 שבועות.
- יש להרדים את בעל החיים באמצעות הזרקה תוך-צפקית של קטמין (200 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג) או לפי תקנות הטיפול בבעלי חיים מוסדיים. תכננו שהחיה תהיה תחת הרדמה למשך כשעה אחת אם משתמשים בהרדמה בהזרקה.
- בדוק שהחיה מורדמת עמוק על ידי צביטה חזקה של כף הרגל. בעל חיים מורדם כראוי לא יגיב לצביטה.
- בעזרת קוצץ, גלח אזור של 2-3 ס"מ2 בצד הגבי של החיה, קרוב לאוזניים. היזהר לא לפגוע באוזניים.
- נגב את האזור עם 70% אתנול שנמרח על כרית גזה. ודא שכל השיער הקצוץ הוסר מהאזור. יש לחטא את האזור ביוד.
- מרחו ג'לי נפט על העיניים כדי למנוע התייבשות לאורך כל ההליך.
- שמור את החיה בתא התאוששות מחומם עד שתהיה מוכנה להתחיל בהליך.
3. בצע את ההליך הכירורגי
הערה: הקפידו על טכניקה אספטית נאותה לכל שלבי ההליך. זה כולל שימוש נכון בכפפות, רשתות שיער, מסכות ווילונות. יש לעקר את כל הכלים לפני שבאים במגע עם החיה.
- העבירו את החיה למסגרת סטריאוטקטית, צד הגב כלפי מעלה, מוגבהת בחלק האמצעי על ידי מגבות נייר מקופלות כדי להגזים בעקמומיות עמוד השדרה. מהדקים את הזרועות והזנב בעזרת סרט כירורגי ואבטחו את הראש בעזרת מהדק שן. ייצוב מוטות אוזניים אינו הכרחי להליך זה.
- השתמש באזמל כדי ליצור חתך בקו האמצע של 3 ס"מ, החל ממש מתחת לאוזניים וחותך בכיוון הזנב.
- אתר את החלוקה בין שני מבני השומן הגדולים והשתמש במלקחיים עדינים בכל יד כדי להפריד ביניהם. פרשו מחזירים כדי לפתוח את שדה הניתוח.
- תחת מיקרוסקופ כירורגי, אתר את תהליך הצמיחה הבולט של חוליית בית החזה 2 (T2) ( הערה: תכונה זו אופיינית לזן העכבר C57BL/6). בצע דיסקציה קהה עם מספריים קפיציים סגורים דרך שרירי הכיסוי כדי לדמיין טוב יותר את T2. בעזרת המלקחיים, יש לחוש את המשטחים הקשים של חוליית בית החזה 3 (T3) וחוליית בית החזה 4 (T4) כדי לאשר מיקום אנטומי תקין.
- בעזרת מספריים קפיציים, בצע חתכים רוחביים רדודים (בעומק 2-3 מ"מ) של רקמת החיבור בין T3 ל- T4. בשל המרווח הטבעי בין חוליות בחלק בית החזה העליון של עמוד השדרה של העכבר, אין צורך בכריתת למינקטומיה כדי לחשוף את חוט השדרה. שימו לב שחתך עמוק מדי ינקב ויפגע בכבל.
הערה: דרגה קטנה של דימום שכיחה במהלך שלב זה. אם זה קורה, החזק חנית ספוג לאזור עד שהדימום שוכך (30-60 שניות).
- דמיין את חוט השדרה. הוא יכוסה בשכבה עבה של דורה גלויה אם שכבת קרום המוח הזו עדיין לא נחתכת בזמן חשיפת הכבל. כלי דם בולט עובר דרך קו האמצע המשוער של חוט השדרה.
הערה: אין להשתמש בכלי הדם הזה כציון דרך לקו האמצע. במקום זאת, תאורה נאותה צריכה לחשוף את גבולות החומר האפור-לבן המאגפים את עמוד הגב, ויש להשתמש בהם כדי להעריך את קו האמצע.
- אם הדורה נשארת שלמה, בצע שריטות רוחביות עדינות עם מחט מתכת 32 גרם עד לניקוי. המטרה היא להסיר את הדורה מבלי לחתוך את קרומי המוח הנותרים, שאינם עבים וקשים יותר לראייה.
הערה: שחרור נוזל המוח מעיד על פריצה של הארכנואיד, ולמרות שזה יכול להתרחש ללא נזק מכני לרקמה, יש להסיר את נוזל השדרה המצטבר בעזרת חנית ספוג כדי לדמיין טוב יותר את פני השטח של חוט הטבור.
- הזיזו את מזרק ההזרקה למקומו והורידו אותו לאט לאט עד שקצה הנימים בקושי נוגע בחוט השדרה מיד לרוחב משני צידי קו האמצע. נעל את הזרוע במקומה.
- השתמש במדידות המדורגות של הזרוע הסטריאוטקטית בכיוון Z כדי לבצע מדידת מיקום בסיסית. מקריאה זו, הפחיתו 1.3 מ"מ. השתמש בתנועה מהירה ורדודה כלפי מטה כדי לנקב את הרקמה ולהוריד בזהירות את הנימים עד להגעה למדידה החדשה. אופציונלי: אם תרצה, נגעים בעמוד הגב יכולים להיווצר על ידי אותה תנועת פירסינג בקו האמצע ובעומק של 0.3 מ"מ.
הערה: ערכים אלה ספציפיים להזרקה בין T3 ל-T4. אם בוחרים לבצע את ההזרקה בכל מקום אחר בחוט השדרה, יש לגזור ערכים אלה מכל אטלס מוח עכבר זמין.
- השתמש במיקרומניפולטור כדי לדכא ליזולציטין לתוך החומר הלבן של חוט השדרה הגחוני. בצע סיבוב אחד של המיקרומניפולטור כל 5 שניות למשך 2 דקות, וכתוצאה מכך נפח סופי של 0.5 מיקרוליטר. השאירו את הנימים במקומו למשך 2 דקות נוספות כדי למנוע זרימה חוזרת של התמיסה, ולאחר מכן הסירו בזהירות את הנימים.
- קשרו תפר בודד ברקמת השריר/השומן המכסה את עמוד השדרה. השתמש בתפר ללא הפרעה כדי לסגור את העור. מרחו עוד יוד על מקום החתך.
- הניחו את החיה בתא התאוששות מחומם עד שהיא מתאוששת, ואז החזירו אותה לכלוב שלה. יש למרוח משככי כאבים לאחר הניתוח בהתאם לתקנות הטיפול בבעלי חיים במוסדות. בדרך כלל אין צורך בטיפול נוסף לאחר הניתוח מכיוון שבעלי החיים הם אמבולטוריים לחלוטין ומסוגלים להאכיל ולשתות בעצמם ברגע שהם מתאוששים מההרדמה.
- חזור על ההליך עבור שאר בעלי החיים.
הערה: עם מיומנות, ניתן להשלים את הפעולה תוך 10-15 דקות לכל בעל חיים, במיוחד בעזרת אדם שני הקושר תפרים. ניתן להשתמש באותו נימי זכוכית לכ-15-20 ניתוחים לפני שהקצה הופך קהה ויש להחליפו. ניתוחי בקרה יכולים להתבצע באופן זהה למתואר, עם הזרקת PBS לחוט השדרה במקום ליזולציטין. אנו לא ממליצים לנקות את הנימים לשימוש עתידי.
