גרימת פגיעה עצבית ממוקדת באמצעות לייזר בעל עוצמה גבוהה בזחל דרוזופילה

תקציר

מקור: Li, D., Li, F., et al. מודל פגיעה של דרוזופילה in vivo לחקר התחדשות עצבית במערכת העצבים ההיקפית והמרכזית. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים שיטה לגרימת פגיעה עצבית ממוקדת בזחלי Drosophila באמצעות לייזר בעל עוצמה גבוהה. לאחר מיקום הזחל מתחת למיקרוסקופ, לייזר בעל הספק נמוך סורק אחר נוירונים פלואורסצנטיים, ואז עוצמת הלייזר מוגברת כדי לגרום לנזק מקומי. הפציעה מאושרת על ידי פלואורסצנטיות מוגברת ומכתש באתר הפציעה.

פרוטוקול

1. פגיעה דו-פוטונית והדמיה קונפוקלית

1. הגדרת מיקרוסקופ
   הערה: מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי עם לייזר דו-פוטוני שימש לניסוי זה, אך מערכות אחרות עם הגדרה מקבילה יספיקו גם הן. הלייזר הדו-פוטוני (930 ננומטר) שימש להעברת פציעות ולייזר ארגון (488 ננומטר) שימש להדמיה קונפוקלית של GFP.
   1. בתחילת כל מפגש, הפעל את הלייזר הדו-פוטוני ו/או את הלייזר הקונפוקלי ואת המיקרוסקופ. לאחר מכן, פתח את תוכנת ההדמיה.
   2. עבור פגיעה בשני פוטונים, הגדר את הפרמטרים הבאים להדמיית GFP עם לייזר דו-פוטוני ב-930 ננומטר (1,950 mW).
      1. בחר מצב סריקת קו. פתח את חור הסיכה עד הסוף. הגדל את עוצמת הלייזר ל-~20% (390 mW).
      2. בחר/י 512 x 512 כסריקת הפריימים. השתמש/י במהירות סריקה מקסימלית (בדרך כלל כאשר זמן השתהות הפיקסלים הוא 0.77 מיקרומטר). ודא שהמספר הממוצע הוא 1 ועומק הסיביות הוא 8 סיביות.
      3. הגדר את הרווח ל-~750 ואת ההיסט ל-0.
      4. שמור את הפרוטוקול הניסיוני המוגדר מראש כ-2P GFP 930 Ablation, המאפשר שימוש חוזר קל בניסויים עתידיים.
   3. להדמיה קונפוקלית, הגדר את הפרמטרים הבאים להדמיית GFP עם לייזר ארגון ב-488 ננומטר:
      1. בחר את הכרטיסייה Acquisition ולאחר מכן Z-stack.
      2. תחת "לייזר", הפעל את הכוח עבור לייזר ארגון 488 ננומטר.
      3. עבור אל ערוצים, בחר את הלייזר 488 מ"מ והגדל את עוצמת הלייזר ל-5-10%. עבור חור הסיכה, השתמש ביחידה האוורירית 1-2 (AU). התאם את הרווח ל-650.
      4. במצב רכישה, בחר 1024 x 1024 כסריקת הפריימים, השתמש במהירות הסריקה המרבית, במספר ממוצע של 2 ובעומק סיביות של 8 סיביות.
      5. שמור את פרוטוקול הניסוי המוגדר מראש כהדמיית GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק).
2. הרדמת זחלים עם אתר דיאתיל והרכבה
   1. בתוך קולט אדים, הניחו צלחת זכוכית בקוטר 60 מ"מ בצלחת פטרי מפלסטיק בקוטר 15 ס"מ. מקפלים ומניחים פיסת נייר טישו בתחתית צלחת הזכוכית, ואז מניחים צלחת אגר מיץ ענבים על הטישו. הוסף אתר דיאתיל לכלי הזכוכית, עד לנקודה שבה נייר הטישו ספוג ונותרה שכבה של אתר נוזלי בכלי. שמור על המכסה פתוח כל הזמן.
   2. הכן שקופית זכוכית עם טיפה אחת של שמן הלופחמן 27 במרכז. הוסף 4 כתמים של שומן ואקום על ארבע פינות השקופית, כדי לתמוך מאוחר יותר בכיסוי.
   3. השתמש במלקחיים כדי להרים זחל נקי ולהניח אותו על צלחת האגר בצלחת הזכוכית בקוטר 60 מ"מ. מכסים את כלי הזכוכית במכסה ומחכים עד שהזחל יפסיק לנוע. לפציעה/הדמיה של PNS, הוציאו את הזחל ברגע שהזנב שלו מפסיק להתעוות. עבור מערכת העצבים המרכזית, המתן עד שכל הזחל יהפוך לחסר תנועה, במיוחד מקטעי הראש.
      הערה: תזמון החשיפה לאתר הוא קריטי. ראה דיון.
   4. הרם בזהירות את הזחל המורדם והניח אותו עם הראש זקוף לתוך טיפת שמן הלוקרבון על המגלשה. הוסף כיסוי על גבי השקופית. השתמש בלחץ עדין כדי לדחוף כלפי מטה את הכיסוי, עד שהוא נוגע בזחל (איור 1A).
   5. התאימו את מיקום הזחל על ידי דחיפה עדינה של הכיסוי שמאלה או ימינה כדי לגלגל את הזחל, כך שהנוירון/אקסון/דנדריט המעניין יהיה בחלק העליון והקרוב ביותר לעדשת המיקרוסקופ.
   6. במקרה של פגיעה ב-PNS, הרכיבו את הצד הגבי של הזחל כלפי מעלה, כך ששני קנה הנשימה נראים לעין. לאחר מכן גלגלו את הזחל ~30 מעלות שמאלה לפגיעה באקסונים מסוג III da נוירונים (איור 1B ו-1C), 90 מעלות לפגיעה באקסונים מסוג IV da נוירונים (איור 1B ו-1E), או ~30 מעלות לפגיעה בדנדריטים מסוג IV da נוירון .
   7. עבור פגיעה במערכת העצבים המרכזית, מקם את הזחל כך שיהיה צד גחון מושלם כלפי מעלה, כך שאזור העניין יהיה הקרוב ביותר לעדשת המיקרוסקופ במישור z.
3. פגיעה על ידי לייזר דו-פוטוני
   1. הנח את השקופית עם הזחל מתחת למיקרוסקופ ואבטח אותה במקומה עם מחזיק השקופיות על הבמה. השתמש במטרה 10X (0.3 NA) כדי למצוא את הזחל.
   2. הוסף טיפה אחת של שמן אובייקטיבי על הכיסוי, עבור למטרה 40X (1.3 NA) והתאם את המיקוד.
   3. עבור למצב סריקה ועשה שימוש חוזר בפרוטוקול הניסיוני 2P GFP 930 Ablation. ודא שהחור פתוח עד הסוף.
      הערה: יש למטב את התצורה בהתבסס על מערכות בודדות.
   4. הפעל את מצב Live כדי לאתר את אזור העניין (ROI), וכוונן את ההגדרות כדי להשיג איכות תמונה טובה עם הזום המתאים.
      הערה: מטרת שלב זה היא למצוא את הנוירון/אקסון/דנדריט לפציעה, במקום לצלם את התמונה האיכותית ביותר. לכן, השתמש בהגדרות המינימליות המספיקות כדי לדמיין את אזור היעד, על מנת למנוע חשיפת יתר או הלבנת אור.
   5. הפסק סריקה חיה, כך שלחצן חיתוך יהפוך לזמין. תנו לתמונת הסטילס לשמש כמפת הדרכים. בחר בפונקציית החיתוך והתאם את חלון הסריקה כדי להתמקד במטרה שתיפצע.
   6. צמצם את ההחזר על ההשקעה לגודל אתר הפציעה הפוטנציאלי. לדוגמה, פשוט כסו את הרוחב של אקסון או דנדריט, כדי להבטיח את דיוק הפגיעה ולהפחית את הנזק לרקמות שכנות. אם תרצה, הגדל את ההחזר על ההשקעה לפני החיתוך, מה שמאפשר פציעה מדויקת יותר.
   7. פתח חלון הדמיה חדש. הפחת את מהירות הסריקה והגבר את עוצמת הלייזר. קבע את העלייה בעוצמת הלייזר בהתבסס על אות הקרינה של הרקמה שנסרק במצב חי.
   8. בדרך כלל, הגדר את עוצמת הלייזר הדו-פוטוני החל מ-25% עבור פגיעת PNS ו-50-100% עבור פגיעת VNC. עבור פציעת אקסון PNS, ודא שעוצמת הלייזר היא ~480 mW וזמן השהייה של הפיקסלים הוא 8.19 μs. עבור פגיעת אקסון VNC, ודא שעוצמת הלייזר וזמן השהייה של הפיקסלים הם בדרך כלל 965-1930 mW ו- 8.19-32.77 μs, בהתאמה.
   9. התחל סריקה רציפה. השאר את הסמן מרחף מעל הלחצן רציף. עקוב מקרוב אחר התמונה ועצור את הסריקה ברגע שנצפתה עלייה דרסטית בקרינה.
      הערה: הופעת ספייק הקרינה נובעת מפלואורסצנציה עצמית באתר הפציעה.
   10. חזור למצב Live על ידי שימוש חוזר בהגדרות. מצא את אזור העניין שסומן זה עתה על ידי התאמת המיקוד.
       הערה: אינדיקציה טובה לפציעה מוצלחת היא הופעת מכתש קטן, מבנה דמוי טבעת או פסולת מקומית ממש במקום הפציעה.
   11. עברו לנוירון הבא וחזרו על הפעולה משלב 1.3.5, כדי לפגוע בתאי עצב מרובים בחיה אחת. או חזור על שלב 3.3.5 תוך הגדלה הדרגתית של העוצמה ו/או הפחתת מהירות הסריקה אם הפציעה הראשונית לא הייתה מספקת.
       הערה: במקרה שעוצמת הלייזר גבוהה מדי, אזור פגום גדול יהיה גלוי בתמונת הסריקה החיה לאחר הפציעה. פציעה רבה מדי עלולה לגרום למותו של הזחל.
   12. שחזר את הזחל על ידי הסרת הכיסוי בזהירות והעברת הזחל הפגוע לצלחת חדשה עם משחת שמרים. תעלה כמה מערות על צלחת האגר בעזרת מלקחיים; לחלופין, הכינו אי של אגר בצלחת במקום להשתמש בצלחת כולה, כדי להפחית את האפשרות שהזחל יזחל החוצה מהצלחת.
   13. הכניסו את הצלחת לצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ עם רקמה רטובה (ספוגה בתמיסת חומצה פרופיונית של 0.5%) ותרבית בטמפרטורת החדר או 25 מעלות צלזיוס><. הערה: הזחל יישאר בשלב הזחל למשך יום נוסף בערך בטמפרטורת החדר (22 מעלות צלזיוס) לעומת 25 מעלות צלזיוס.

תוצאות

איור 1: רגנרציה של אקסון נוירונים Da בפריפריה מציגה ספציפיות של מחלקה. (A ו-B) שרטוט סכמטי המציג את מיקום הזחלים. (C) שרטוט סכמטי של תאי עצב מסוג III. (D) אקסונים מסוג III da נוירונים ddaF, המסומנים ב-19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80/+, לא מצליחים לצמוח מחדש. (E) שרטוט סכמטי של תאי עצב מסוג IV. (F) אקסונים מסוג IV da נוירונים v'ada, שמסומנים ב-ppk-CD4-tdGFP/+, גדלים מחדש מעבר לאתר הנגע. (D ו-F...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אתר דיאתיל, מגיב ACS, נטול מים	אקרוס אורגניקס	AC615080010
שמן הלופחמן 27	ג'נסי מדעי	59-133
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS), תרכיז פי 20, pH 7.5, ספק # E703-1L	VWR	97062-948
אבקת אגר, אלפא אזר, 500 גרם	VWR	AAA10752-36
מיץ ענבים	וולש
אתנול 95% (ריאגנט אלכוהול 95%)	VWR	64-17-5
חומצה אצטית	סיגמא-אולדריץ'	A6283
חומצה פרופיונית	ג'יי טי בייקר	U33007
משקפי כיסוי: מלבנים	פישר סיינטיפיק	12-544-D	50 מ"מ X 22 מ"מ
מיקרוסקופ סריקת לייזר Zeiss LSM 880	צייס
תוכנת זן	צייס
זיקית אולטרה II	קוהרנטי