התמרה מתווכת לנטיוויראלית של נוירונים אנושיים לניתוח צבירת חלבון טאו

תקציר

מקור: Aulston, B., et al. מודל במבחנה לחקר צבירת טאו באמצעות התמרה מתווכת לנטיוויראלית של נוירונים אנושיים.

סרטון זה מדגים את תהליך התמרת תאי עצב אנושיים עם נגיף לנטי המקודד חלבון טאו אנושי מוטנטי המתויג בחלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) כדי לחקור צבירת חלבונים. הוא מתאר את השלבים מכניסה ויראלית לביטוי טאו מוטנטי, ומגיע לשיאו בהיווצרות אגרגטים ציטופלזמיים גלויים בתאי העצב.

פרוטוקול

1. הכנת מדיה וריאגנטים

1. הפשירו את ציפוי מטריצת קרום המרתף ללוחות תרבית ב-4 מעלות צלזיוס (אל תאפשר למטריצת קרום המרתף להתחמם, אחרת היא תתמצק). הכינו 1 מ"ל ואחסן אותם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס או -70 מעלות צלזיוס.
2. הרכיבו מחדש את גורם הגדילה הפיברובלסטים הבסיסי (bFGF) בתמיסת מלח סטרילית עם פוספט (PBS) ב-10 מיקרוגרם/מ"ל וצרו 10 מיקרוליטר מינואות. אחסן אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
3. לבקבוק חדש של 500 מ"ל DMEM/F12 עם גלוטמין שלא נפתח, הוסיפו B27 (10 מ"ל), N2 (5 מ"ל) ופניצילין-סטרפטומיצין (5 מ"ל). הנח 50 מ"ל ממדיה זו של תאי גזע עצביים (NSC) בצינור חרוטי והוסף 10 מיקרוליטר של 10 מיקרוגרם/מיקרוליטר (2 מיקרוגרם/מ"ל סופי) bFGF. אחסן את מדיית NSC (+) bFGF ב-4 מעלות צלזיוס.
4. כדי ליצור (-) מדיית bFGF, השתמש באותו מתכון כמתואר בשלב 1.3 אך אל תוסיף bFGF. מדיה זו תשמש להבדיל תאי גזע עצביים לנוירונים ולשמירה על תרביות עצביות לאחר התמיינות.

2. מבנים לנטי-ויראליים

הערה: לפני תחילת העבודה עם מבנים לנטי-ויראליים, ודא שהמעבדה אושרה לשימוש בחומרים ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2). יתר על כן, יש להשתמש במכסי תרבית BSL-2, ציוד מגן אישי (PPE) ושיטות סילוק בעת עבודה עם וקטורים לנטי-ויראליים.

1. השג מבני טאו ארוזים ב-lentivirus ממקור מועדף.

3. תרבית תאי גזע עצביים אנושיים

הערה: NSCs נזרעים בדרך כלל ב-100,000-150,000 תאים/ס"מ² ורוב ה-NSCs הזמינים מסחרית נמכרים כ-1 x 10⁶ תאים/בקבוקון. פרוטוקול זה מותאם לצלחות תרבית תאים של 10 ס"מ (אם כי ניתן להשתמש בגדלים אחרים של כלים); לכן, אם נעשה שימוש ב-NSCs זמינים מסחרית, ייתכן שיהיה צורך להרחיב את ה-NSCs על ידי תרבית תחילה בכלים של שש בארות על מנת לגרום למספיק תאים כדי לזרוע כלים של 10 ס"מ. לחלופין, ניתן להתאים פרוטוקול זה למגוון גדלים של צלחות תרבית תאים.

1. להכנת צלחות תרבית תאים, הסר מנה אחת של ציפוי מטריצת קרום מרתף קפוא עבור צלחות תרבית תאים ואפשר לו להפשיר ב-4 מעלות צלזיוס (ניתן להניח עליות ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה יום לפני זריעת התאים). הוסף 385 מיקרוליטר של ציפוי מטריצת ממברנת הבסיס ל-5 מ"ל של מדיה DMEM/F12 + פניצילין-סטרפטומיצין.
   הערה: 5 מ"ל של מדיה DMEM/F12 + פניצילין-סטרפטומיצין מספיקים לציפוי צלחת בודדת של 10 ס"מ (1 מ"ל של תמיסת ציפוי מטריצת קרום מרתף זו מספיקה לציפוי באר אחת של צלחת בת שש בארות). לחלופין, אם התאים אמורים להיות קבועים ומוכתמים חיסונית, או מוכתמים בתיופלבין, תאי תרבית על כיסויי זכוכית בכלי תרבית של 24 בארות.
   1. שמור על המדיה וציפוי המטריצה קרים לפני ותוך כדי הוספתם לצלחות תרבות. מוסיפים את ציפוי מטריצת קרום המרתף לכלי תרבות ומניחים את הכלים בחממה (בחום של 37 מעלות צלזיוס) למשך שעה. לציפוי אופטימלי, אין לדגור את מטריצת קרום המרתף למשך יותר או פחות משעה. לאחר שעה, שאפו את ציפוי מטריצת קרום הבסיס מכלי תרביות התאים. ודא שזה עולה בקנה אחד עם תאי הגזע העצביים מוכנים לציפוי.
      הערה: אם תאים אינם מופשרים ממלאי קפוא, דלג על שלב 3.2 והמשך לשלב 3.3.
2. אם תאים מופשרים ממאגרי NSC קפואים, קחו בקבוקון של תאים קפואים וחממו אותו באמבט מים שחומם ל-37 מעלות צלזיוס על ידי הזזת הבקבוקון קדימה ואחורה במים. לאחר ההפשרה, רססו את הבקבוקון ב-70% אתנול והניחו אותו במכסה המנוע של תרבית תאים. העבירו את התאים ל-~10 מ"ל של DMEM/F12 + פניצילין-סטרפטומיצין מדיה וצנטריפוגה של הצינור בטמפרטורת החדר ב-1,000 x גרם למשך 5 דקות. שאפו את המדיה והשעו מחדש את התאים בתקשורת NSC.
3. לדלל את התאים במדיה NSC כדי להשיג את צפיפות הזריעה המתאימה לכלי תרבית התאים בו נעשה שימוש.
   הערה: לדוגמה, אם מצופים תאי גזע עצביים על צלחת של שש בארות - לבאר אחת על צלחת תרבית של שש בארות יש שטח פנים של 9 ס"מ² - נדרשים 900,000 עד 1,350,000 תאים כדי לזרוע. לכן, ניתן לתלות בקבוקון אחד המכיל 1,000,000 תאים ב-2 מ"ל של מדיה ולהוסיף לבאר אחת של צלחת של שש בארות.
4. הוסף מספיק תאים תלויים באמצעי NSC כדי לזרוע את צלחות התרבות המצופות מטריצת קרום הבסיס (100,000 תאים/ס"מ²) והחלף את המדיה כל יומיים (אם משתמשים בציר קפוא, החלף את המדיה יום לאחר הציפוי וכל יומיים לאחר מכן). גדל את התאים עד שהם מתכנסים 75%-80%.
   הערה: התאים יגיעו ככל הנראה למפגש של 75%-80% זמן קצר לאחר הציפוי, אך זה עשוי להימשך זמן רב יותר אם משתמשים במלאי קפוא.
5. ברגע שתאי הגזע העצביים מתכנסים ב-75%-80%, התחילו בהתמיינות עצבית על ידי הסרת מדיית ה-NSC (+) bFGF והחלפתה במדיית NSC (-) bFGF. תרבית התאים במדיה זו (החלפת המדיה כל יומיים) למשך 4 שבועות לפחות.
   הערה: התאים ימשיכו להתחלק במשך מספר ימים לאחר נסיגת bFGF; לכן, תאים עשויים להגיע למפגש של 90-100%.
6. לאחר תרבית במשך 4 שבועות, התאים ישיגו גורל עצבי ויהיו מוכנים לטיפול בנגיף הלנטי.

4. התמרה ותחזוקה של תרביות עצביות

1. כדי להמיר נוירונים עם lentivirus, השתמש בספירת טיטר של 3.4 x 10⁵ יחידות/תא הניתנות להעברה (צלחת 100% 10 ס"מ תכיל ~10 מיליון נוירונים). לדלל את היחידות הניתנות להעברה לריכוז הדרוש במצע תרבית התאים ולהוסיף אותן לתאים (השתמש בנפח המדיה הרגיל לצלחת תרבית התאים). יומיים לאחר הוספת ה-lentivirus, שטפו את התאים 1x במדיה bFGF טרייה (-) (ללא lentivirus) והמשיכו בתרבית במדיה (-) bFGF כרגיל.
2. עבור הטיפול הפוסט-לנטי-ויראלי, הזינו את הנוירונים המומרים על ידי החלפת מצע תרבית התאים ([-] bFGF media) כל יומיים. שמור על התאים במשך ~8 שבועות לאחר ההעברה. דמיין באופן שגרתי את התאים תחת מיקרוסקופ אור כדי להבטיח כדאיות.
   הערה: דלילות או שברים דנדריטיים הם סימנים לכך שהתאים אינם ברי קיימא יותר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
10 ס"מ כלי תרבית	תרמופישר	12556002
50 מ"ל שפופרות	ביו-פיוניר	CNT-50
70% אתנול בבקבוק ריסוס	מקורות שונים	NA
תוספת B27	תרמופישר	17504044
מטריצת ממברנת הבסיס (Matrigel)	קורנינג	356231
FGF בסיסי	ביו-פיוניר	HRP-0011
אלבומין בסרום בקר	סיגמא	A7906
חממת תרביות תאים	מקורות שונים	NA
צנטריפוגה	מקורות שונים	NA
מדיית תרבית DMEM-F12 עם גלוטמין	תרמופישר	10565042
אתנול (ריכוז 50% ומעלה)	מקורות שונים	NA
תאי גזע עצביים אנושיים	מקורות שונים	NA
וקטורים לנטיויראליים	מקורות שונים	סדר מותאם אישית
תוספת N2	תרמופישר	17502048
פניצילין-סטרפטומיצין	תרמופישר	15140122
פוספט חוצץ מלח	תרמופישר	14190250
מכסה מנוע סטרילי של תרבית תאים	מקורות שונים	NA
אמבט מים	מקורות שונים	NA