הקמת מודל חולדה דימום תת-עכבישי המושרה על ידי הזרקת דם אוטולוגית

תקציר

מקור: Bömers, J. et al. הזרקה פרה-כיאזמטית של דם אוטולוגי כדי לגרום לדימום תת-עכבישי ניסיוני במודל חולדות. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים את הנוהל להקמת מודל חולדה לדימום תת-עכבישי. חולדה מורדמת מושתלת בבדיקות למדידת לחץ תוך גולגולתי וזרימת דם מוחית. אתר המטרה מזוהה, והמחט מוחדרת במצב טרום-כיאזמטי. לאחר מכן מוזרק דם אוטולוגי לחלל התת-עכבישי, מגביר את הלחץ התוך גולגולתי ומפחית את זרימת הדם המוחית, ומבסס את המודל.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הכנות

1. שנה קטטר ורידים היקפיים של 16 גרם לאינטובציה. כדי לשנות, קצר את המחט ב-1 ס"מ וכופף את הדיסטלי הנותר 1 ס"מ על 30° לכיוון שסתום ההזרקה. הסר את כנפי הקטטר (לשימוש רב פעמי).
2. כדי לבצע לחץ תוך גולגולתי או בדיקת ICP, חותכים חתיכה של צינור פוליאתן בגודל 20 מ"מ (קוטר פנימי (ID): 0.58 מ"מ, קוטר חיצוני (OD): 0.96 מ"מ) ושורפים קצה אחד ליצירת צלחת עגולה, תוך שמירה על לומן פתוח. עקוף את צינורות הפוליאתן עם 1 מ"מ של צינורות סיליקון (ID: 1.0 מ"מ, OD: 3.0 מ"מ) לפני חיבור 10 מ"מ של צינורות סיליקון (ID: 0.76 מ"מ, OD: 2.4 מ"מ) לקצה צינור הפוליאתילן.
3. הפעל את המחשב הנייד ופתח את תוכנת רכישת הנתונים. כייל את מתמרי לחץ הדם (BP) והלחץ התוך מוחי (ICP) ואת הלייזר-דופלר בהתאם להוראות היצרן.
4. הכן את מנגנון מנתח גזי הדם.
   זהירות: ודא שיש מספיק איזופלורן בוופורייזר.
5. הפעל את O₂ ואת זרימת האוויר האטמוספרי. הגדר את הזרימה של O₂ ב-30% ואת האוויר האטמוספרי ב-70%.
6. הנח את כרית החימום והגדר את הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס.

2. הרדמה

1. הניחו את החולדה בתא ההרדמה עם זרימה של 30% מ-O₂ ו-70% מהאוויר האטמוספרי. יש לתת 5% מגז האיזופלורן לתוך החדר. הרדמה מספקת תארך כ-4 דקות. שלוט בנשימה בזהירות.
2. לאחר ההרדמה, הניחו את החולדה במצב שכיבה על צלחת כבדה שעוקפת גומיה. הניחו את השיניים הקדמיות של החולדה מתחת לגומייה.
3. משוך את הלשון החוצה בזהירות בעזרת מלקחיים מעוקלים. נקו את הגרון בעזרת קצה כותנה. הנח אור חיצוני בקו האמצע של הגרון כדי לדמיין את מיתרי הקול.
4. אינטובציה במהלך ההשראה באמצעות קטטר ורידים היקפיים 16 G מותאם. כאשר הוא מוכנס כהלכה, הסר את הסטילטו. חבר את הקטטר למכונת ההנשמה.
   הערה: מיקום נכון של הצינור מאושר על ידי תנועות חזה מסונכרנות עם קצב הנשימה. אם רואים תנועות של הבטן, יש להוציא את החולדה ולהכניס אותה מחדש לפעמון ההרדמה. אל תחזור על ההליך יותר משלוש פעמים בגלל הסיכון לפגיעה בדרכי הנשימה.
5. בעת אינטובציה, החזיקו את החיה בהנשמה מלאכותית עם 30% מ-O₂ ו-70% מהאוויר האטמוספרי. שמור על ההרדמה ב-1.5%-3% של איזופלורן. כוונן את האיזופלורן כדי לשמור על לחץ הדם בין 80-100 מ"מ כספית.
6. שמור על נפח השאיבה של מכונת ההנשמה על 3 מ"ל ועל התדר על 40-45 השראות לדקה. התאם את נפח השאיבה בהתאם לניתוח גזי הדם.
7. בצע תפר דרך הרקמה הרכה הפנימית של הלחי עם תפר 2-0. קשרו את התפר סביב צינור ההזרקה ושסתום ההזרקה של קטטר הווריד ההיקפי כדי להדק את הצנתר.
8. העבירו את החולדה לשדה הניתוח והניחו אותה במצב שכיבה כשהזנב פונה לכיוון המנתח.
9. יש למרוח את ג'ל העיניים בעת הצורך כדי להתמודד עם יובש בעיניים.
10. בצע צביטה בבוהן כדי לאשר עומק הרדמה מתאים. להעריך ולשמור על עומק ההרדמה במהלך הניתוח.

3. קטטר זנב

1. יש לחטא את 3-4 ס"מ הפרוקסימלי של הזנב עם 0.5% אתנול כלורהקסידין.
   הערה: מעתה ואילך, השתמש במיקרוסקופ הכירורגי לפי שיקול דעתו של המנתח.
2. בצע חתך עור של 15-20 מ"מ בקצה הפרוקסימלי של הזנב בצד הגחון. היזהר לא לחתוך את העורק.
3. שחרר את העור מרקמת החיבור הבסיסית באמצעות מלקחיים מעוקלים.
4. חודרים בזהירות לפאשיה וחושפים את העורק.
5. שחרר בזהירות את עורק הזנב מהרקמה הבסיסית באמצעות מלקחיים מעוקלים.
6. החלק שלושה חוטי משי שחורים מתחת לכלי. הניחו חוט אחד רחוק ככל האפשר וקשרו קשר כירורגי בחוזקה סביב העורק. החזק את הקצוות הרופפים של החוט בעזרת המוסטט.
7. קושרים את שני החוטים הנותרים בצורה רופפת סביב העורק.
8. דחוף את החוט הפרוקסימלי קרוב ככל האפשר. מרחו המוסטט כדי להחזיק את קצות החוט הפרוקסימלי. משוך את המוסטט קלות, אך מספיק כדי להגביל ולחסום את זרימת הדם. הניחו את המוסטט על הבטן.
9. חותכים את קצה הקטטר בזווית של 45°. חותכים את הנקודה החדה כדי למנוע חדירת דופן עורקים.
10. בעזרת מספריים של ואנאס, בצע חתך בעורק 1/3 מקוטר העורק בזווית של 30 מעלות, 3-5 מ"מ מהקשר הדיסטלי.
11. הכנס את הקטטר לעורק באמצעות שני מלקחיים ישרים. השתמש במלקחיים אחד כדי להחזיק את הקטטר ובשני כדי למשוך בזהירות את העורק מעל הצנתר.
12. הכנס את הצנתר במעלה הכלי לקשר הפרוקסימלי ושחרר את הקשר מההמוסטט. דמיין את זרימת הדם בצנתר. מהדקים את החוט האמצעי בצורה רופפת לקטטר.
13. המשך בהחדרה, ואם אפשר, ממש מעבר לנקודה שבה העורק מכוסה שוב על ידי פאשיה.
14. שלוט במיקום הצנתר ובדליפה אפשרית על ידי שטיפה במי מלח.
15. מהדקים את שני החוטים הפרוקסימליים באמצעות קשרים כירורגיים.
    הערה: מדידת לחץ הדם צריכה להיות פועמת; אם לא, הקטטר אינו ממוקם כראוי.
16. הדק את הקטטר בקצה החתך על ידי קשירת קשר כירורגי באמצעות החוט הדיסטלי.
17. תפר את חתך העור באופן רופף יחד עם שני תפרים מונופילמנטים 4-0 שאינם נספגים. היזהר לא לחדור לקטטר.
    הערה: במהלך הניתוח היו מודעים למשרעת הפעימה. אם זה נמוך, שטוף את הקטטר במי מלח.
18. שחרר את הצנתר העורקי ממתמר הלחץ כדי לאפשר זרימת דם לדגימת גזי דם. הנח צינור מיקרו-נימי בקצה הצנתר. תן לדם לזרום לתוך הצינור. חבר מחדש את הקטטר למתמר לאחר איסוף הדם ושטוף את הקטטר.
19. הכנס את צינור הנימים למנתח גזי הדם. מדוד את ה-pH, pCO₂ ו-pO₂ ורשום אותם
    הערה: בהתאם לערכי הגזים ולחץ הדם, שנה את קצב האוורור. אם הלחץ העורקי הממוצע (MAP) נמוך מדי, נסה להוריד את קצב הזרימה של איזופלורן. בדוק את הרפלקסים כדי להבטיח עומק הרדמה תקין.

4. בדיקת ICP

1. הניחו את החולדה במסגרת הסטריאוטקסית. חשוב למקם את החולדה בצורה סימטרית.
2. הניחו כרית גלילית מתחת למסגרת הסטריאוטקסית כדי ליצור כיפוף קדמי של הצוואר.
3. גלחו את הקרקפת, הצוואר והאזור שמאחורי האוזניים של החולדה. הסר את השיער המיותר.
4. יש לחטא את האזור עם 0.5% אתנול כלורהקסידין.
5. הרדמה מקומית עם 0.7 מ"ל של 10 מ"ג/5 מיקרוגרם/מ"ל לידוקאין עם אדרנלין, הכנס את המחט בקצה הזנב של הגולגולת בקו האמצע. מזריקים לשרירי הצוואר עם 0.3-0.4 מ"ל. הזרקו את השאר תת עורית סביב ולפני הברגמה.
6. בצע חתך בעור מניקוב המחט ~ 8 מ"מ בזנב בקו האמצע.
7. נתח את כל השרירים בצורה בוטה בשכבות כדי לזהות את הממברנה האטלנטואוקסיפיטלית (משולש בצבע שיש בזנב לגולגולת בקו האמצע).
8. השתמש במחזיר Alm כדי לרסן את שרירי הצוואר. הנח את המחזיר החוד בזנב במידת הצורך.
9. בדוק אם בדיקת ה-ICP הסטרילית מחוברת למתמר ICP. שטוף את בדיקת ה-ICP במי מלח. ודא שאין בועות אוויר בבדיקת ה-ICP.
10. חתכו את הממברנה האטלנטואוקסיפיטלית באמצעות מחט 23 גרם. צור חור כדי לשדל את בדיקת ה-ICP דרך הממברנה.
11. שידל את הגשושית דרך הממברנה האטלנטואוקסיפיטלית בעדינות. משוך קלות את הגשושית וודא שהיא מציגה עקומה פועמת הנעה בין 0-5 מ"מ כספית. אם לא, הסר את הבדיקה, בדוק את החיבור למתמר ואשר את הזרימה דרך הלומן.
12. מרחו שתי טיפות מדבק הרקמות. הזיזו את צינור הסיליקון בקוטר 1 מ"מ קדימה אל הממברנה ומרחו דבק נוסף כדי למזער את הסיכון לתזוזה של בדיקת ICP.
13. הסר את המפרק/ים.
14. צור תפר מזרן אופקי אחד לקצה הקפאלי של החתך ותפר אחד קטוע פשוט לקצה הזנב באמצעות תפר מונופילמנט 4-0 שאינו נספג.

5. מיקום המחט ובדיקת הלייזר-דופלר

1. בצע חתך בקו האמצע ממש לפני העיניים, 15 מ"מ זנב.
2. הסר את רקמת החיבור ואת השרירים בעזרת מלקחיים. השתמש בקצה של צמר גפן סטרילי כרוז'ין המאפשר לזהות את הברגמה ואת התפרים העטרתיים.
3. הנח את מפסק Alm.
4. הנח מחט עמוד שדרה 25 גרם במסגרת הסטריאוטקסית. הניחו את המחט בדיוק על הברגמה ושימו לב למיקום.
   הערה: מקם את מפרק קו האמצע של המסגרת הסטריאוטקסית ב-30 מעלות לכיוון החיה במישור האנכי.
5. הסר את המחט מהברגמה, הזז את המסגרת 65 מ"מ קדימה ולאחר מכן החלף את המחט בקו האמצע כדי לסמן את אתר הקידוח.
6. קדחו עד לזיהוי הדורה מאטר מתחת לעצם. הסר בעדינות את שברי העצם בעזרת מלקחיים ישרים ומלא את החלל בשעוות עצם.
7. קדחו חור נוסף 3-4 מ"מ לרוחב מימין לברגמה וממש לפני התפר העטרתי עבור הלייזר-דופלר. אין צורך לקדוח עד העצם. היזהר לא לחדור לדורה מאטר.
8. חפש את הכלים שבהם הלייזר-דופלר יכול למדוד את זרימת הדם. הנח את דופלר הלייזר ובדוק את הערכים. נדרש ערך מינימלי של 100 FU. הסר את המיקרוסקופ (אור מלאכותי).
9. אם הערכים עדיין מקובלים, הוסף טיפת דבק אחת כדי לתקן את הבדיקה.
10. בדוק שוב כדי לאשר אם הערך הוא מעל 80 FU. אם הערך נמוך מ-80 FU, הסר ומקם מחדש את הגשושית כדי להגיע לערך מעל 80 FU.
    הערה: הערך, FU, הוא יחידה שרירותית המציגה זרימת דם מוחית (CBF).

6. אינדוקציה של דימום תת-עכבישי (SAH)

1. הכנס את המחט בעדינות דרך הגולגולת בקו האמצע בין ההמיספרות עד שתורגש התנגדות של בסיס הגולגולת. משוך את המחט ב-1 מ"מ כדי להבטיח מיקום נכון ממש לפני הכיאזמה האופטית.
2. סובב את המחט ב-90 מעלות בכיוון השעון כך שקצה המחט יצביע ימינה כדי להבטיח את התוצאה ההומוגנית ביותר בעת הזרקת הדם. הסר את הסטילטו (איור 1).
3. יש לאזן למשך 15 דקות ולהתאים את רמת ההרדמה לקבלת לחץ דם עורקי ממוצע בטווח של 80-100 מ"מ כספית.
4. בצע ניתוח גזי דם. התאם את רמת ההרדמה בהתאם.
5. משוך 500 מיקרוליטר דם מצנתר הזנב באמצעות מזרק של 1 מ"ל עם מחט קהה של 23 גרם.
6. מלאו את החלל המת של תא המחט בעמוד השדרה בדם כדי למנוע הזרקת אוויר. הסר את מחט ה-23 גרם מהמזרק המלא בדם ואשר שהמזרק מכיל 300 מיקרוליטר דם.
7. חבר את המזרק למחט עמוד השדרה. אחוז בחוזקה והזריק את הדם באופן ידני כדי לעלות על MAP.
8. שימו לב לעלייה תלולה ב-ICP וירידה תלולה ב-CBF במחשב הנייד.
   הערה: CBF צריך להיות 50% או פחות בהשוואה לציון הבסיס למשך 5 דקות לפחות כדי שהניתוח יצליח, ראה איור 2. חולדות דמה אינן עוברות את השלבים 6.1-6.7, ובכך משמיטות את החדרת מחט עמוד השדרה למוח, וממזערות דימום ספונטני אפשרי ונזק מוחי יאטרוגני.

תוצאות

איור 1: סקירה כללית של ההתקנה לפני השראת SAH. מהחלק העליון של התמונה, שימו לב ש-1) מחט ההזרקה, 2) בדיקת לייזר-דופלר ו-3) בדיקת ה-ICP נמצאות כולן במקום.

איור 2: עקבות דגימה לאחר הזרקה תוך-תקלית. הגרף האדום מראה את לחץ הדם במ"מ כספית. הגרף הכחול מציג את...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
16 G קטטר ורידים היקפיים	BD Venflon	393229	מחט מקוצרת, דיסטלית 1 ס"מ מעוקלת. כנפיים הוסרו
פעמון הרדמה	לא ידוע
מנתח גזי דם	רדיומטר	ABL80
מוניטור לחץ דם	מכשירי פרסום	ML117	מתחבר ל- Powerlab
מלקחיים מעוגלים, 12 ס"מ x 3	פ.ס.ט	11001-12	להרדמה
כרית גלילית, 28 ס"מ על 4 ס"מ	תוצרת בית		עשוי ממגבות כירורגיות
חומרת רכישת נתונים	כלי פרסום	ML870 Powerlab
תוכנת רכישת נתונים	כלי פרסום	LabChart 6.0
תרגיל	KMD	1189
בקר מקדחה	סילפרדנט	300 אינץ'
אור גמיש	שוט	KL200
כרית חימום	מינקו	1135
מחט היפודרמית, 20 גרם	KD מדיקל	301300	מתחבר למסגרת סטריאוטקסית
צג ICP	כלי פרסום	ML117	מתחבר ל-Powerlab
וופורייזר איזופלורן	אומדה	TEC3
מחשב נישא	לנובו	T410
מוניטור דופלר לייזר	כלי פרסום	ML191
בדיקת לייזר דופלר	אוקספורד אופטרוניקס	MSF100XP	מתחבר למוניטור דופלר לייזר
מחזיק מחט, 13 ס"מ	פ.ס.ט	12001-13	להרדמה
מזרק מדויק, 0.025 מ"ל	המילטון	547407
מסגרת סטריאוטקסית	Kopf Instruments	M900
מיקרוסקופ כירורגי	קרל זייס	F170
מחט תפרים	אלגייר	1245	להרדמה
בקר טמפרטור	CWE,INC.	TC-1000
מתמר x 2	מכשירי פרסום	MLT0699	מתחבר לצג לחץ דם ו-ICP
מכונת הנשמה	אוגו בזיל	7025
קוצץ וטרינרי	אסקולאפ	GT421
מפסק בלייר בעל 3 שיניים, 13.5 ס"מ	אגנתוס	17022--13
מפסק אלם קהה	פ.ס.ט	17008-07
מלקחיים מעוגלים, 12 ס"מ x 2	פ.ס.ט	11001-12
מחזיק מחט, 13 ס"מ	פ.ס.ט	12001-13
מלקחיים ישרים של דומונט, 11 ס"מ	פ.ס.ט	11252-00
Straight Halsted-Mosquito hemostat x 2	פ.ס.ט	13008-12
מספריים ישרים, 9 ס"מ	פ.ס.ט	14090-09
מספריים ישרים של Vannas, 10.5 ס"מ	פ.ס.ט	15018-10
ספוגיות הניתנות לספיגה	קטנבאך	31603
חוט משי שחור, 4-0, 5X15 ס"מ	Vömel	14757
שעוות עצם	אסקולאפ	1029754
ג'ל עיניים קרבומר 2 מ"ג/גרם	פרנובה
צמר גפן	היינץ הרנץ	WA-1
אפליקטור עם קצה כותנה x 4	סלפה	120788
מחט היפודרמית, 23 גרם x2	KD מדיקל	900284	מתחבר לתא עצירה. הסרת קצה דיסטלי
מחט היפודרמית, 23 גרם x3	KD מדיקל	900284	הסר את הקצה הדיסטלי. 2 מתחבר ל-stopcock, 1 למזרק
בדיקת ICP:	תוצרת בית		מורכב מהבאים:
צינורות פוליאתילן, 20 מ"מ	סמיתס רפואי	800/100/200	קוטר פנימי (ID): 0.58 מ"מ, קוטר חיצוני (OD): 0.96 מ"מ.
צינורות סיליקון, 10 מ"מ	פישר	15202710	ID: 0.76 מ"מ, OD: 2.4 מ"מ.
צינורות סיליקון, 2 מ"מ	פישר	11716513	ID: 1.0 מ"מ, OD: 3.0 מ"מ.
צינורות מיקרו המטוקריט	מותג	7493 11
מגבת OP, 45 ס"מ על 75 ס"מ	Mölnlycke	800430
מתאם PinPort, 22 G	אינסטק	PNP3F22
מזרק PinPort	אינסטק	PNP3M
צינורות פוליאתילן, 2X20 ס"מ	סמיתס רפואי	800/100/200	מתחבר למזרק. ID: 0.58 מ"מ, OD: 0.96 מ"מ.
סרט גומי	לא ידוע
אזמל, 10 להבים	קיאטו	23110
מחט ספינל, 25 גרם x 3.5''	בראון	5405905-01
Stopcock system, Discofix x 2	בראון	16494C	מתחבר למתמר
תפירה, 4-0, מונופיל, לא נספג x 3	אתיקון	EH7145H
מזרק, 1 מ"ל	BD Plastipak	1710023
מזרק, luer-lock, 10 מ"ל x 4	BD Plastipak	305959	מתחבר למתמר
דבק דבק רקמות	3M	1469SB
0.5% אלכוהול כלורהקסידין	פאבורג פארמה	210918
קרפרופן 50 מ"ג/מ"ל	ScanVet	43715	מדולל 1:10
איזופלורן	בקסטר
תמיסת מלח איזוטונית	אמגרוס	16404
לידוקאין-אדרנלין 10 מ"ג/5 מיקרוגרם/מ"ל	אמגרוס	16318