מדידת פרמטרים מיטוכונדריאלים מרובים בתאי עצב באמצעות זרימה ציטומטרית

Abstract

מקור: Liang, K. X., et al. ניתוח ציטומטרי זרימה של פרמטרים מיטוכונדריאלים מרובים בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים ונגזרותיהם העצביות והגליה. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים את התיוג של תאים עצביים עם נוגדנים לקומפלקסים של שרשרת נשימה מיטוכונדריאלית, חלבון הקשור ל-DNA מיטוכונדריאלי וחלבון הממברנה החיצונית המיטוכונדריאלית, ואחריו זרימה ציטומטרית כדי לכמת את רמותיהם.

Protocol

1. מדידת ציטומטריית זרימה של תת-יחידות מורכבות MRC (שרשרת נשימה מיטוכונדריאלית) ו-TFAM (גורם שעתוק מיטוכונדריאלי A) בתאים קבועים

1. בסוף תקופת התרבית, נתק את התאים (~10⁶) על ידי הוספת מגיב הדיסוציאציה של התא; לאחר מכן, גלולה ואספה את התאים בצינור של 15 מ"ל. שטפו את התאים על ידי צנטריפוגה עם מי מלח חוצצים פוספט (PBS) (1x) פעמיים על ידי צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות.
2. תקן את התאים ב-1.6% פרפורמלדהיד (PFA) (1 מ"ל של 1.6% PFA בשפופרת של 15 מ"ל) בטמפרטורת החדר (RT) למשך 10 דקות. שטפו את התאים על ידי צנטריפוגה עם PBS (1x) פעמיים על ידי צנטריפוגה בחום של 300 × גרם למשך 5 דקות.
3. לחדור לתאים עם 90% מתנול קר כקרח (1 מ"ל של 90% מתנול בשפופרת של 15 מ"ל) בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
4. חסום את הדגימות במאגר חוסם המכיל 0.3 M גליצין, 5% סרום עיזים ו-1% אלבומין בסרום בקר (BSA) - Fraction V ב-PBS (1x) (1 מ"ל של מאגר חוסם בשפופרת של 15 מ"ל). שטפו את התאים על ידי צנטריפוגה עם PBS (1x) פעמיים.
5. דגרו על התאים עם הנוגדנים העיקריים הבאים למשך 30 דקות: אנטי-NDUFB10 (1:1,000) למדידת תת-יחידה מורכבת I, תת-יחידה A של קומפלקס דהידרוגנאז אנטי-סוקסינט (SDHA, 1:1,000) למדידת תת-יחידה II מורכבת ואנטי-COX IV (1:1,000) למדידת תת-יחידה IV מורכבת, ונוגדנים אנטי-TFAM (גורם שעתוק מיטוכונדריאלי A) מצומד עם Alexa Fluor 488 (1:400). יש לצבוע את אותו מספר תאים בנפרד עם נוגדן אנטי-TOMM20 (טרנסלוקז של הממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית 20) מצומד עם Alexa Fluor 488 (1:400) למשך 30 דקות (1 מ"ל של תמיסת נוגדנים ראשונית בשפופרת של 15 מ"ל; ראה טבלת החומרים לפרטים על הנוגדנים).
6. שטפו את התאים עם PBS (1x) פעם אחת עם צנטריפוגה ב-300 × g למשך 5 דקות. הוסף נוגדן משני (1:400) לתוך צינורות של NDUFB10, SDHA ו-COX IV ודגר על התאים עם תמיסות אלה למשך 30 דקות.
7. שטפו את התאים עם PBS (1x) פעם אחת על ידי צנטריפוגה ב-300 × g למשך 5 דקות. שאפו את הסופרנטנטים והשאירו כ-100 מיקרוליטר בצינורות. השעו מחדש את כדורי התא ב-300 מיקרוליטר של PBS (1x). העבירו את התאים לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל המוחזקים בחושך על קרח.
8. נתח את התאים על ציטומטר הזרימה (עם תצורת לייזר 3 כחול ו-1 אדום). זהה אותות במסנן 1 (FL1) באמצעות מסנן פס-פס 530/30.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
אנטי-TFAM מצומד עם Alexa Fluor 488	אבקאם	ab198308	נוגדן ראשוני; השתמש כ-1:400, 2.5 מיקרוליטר בתמיסת צביעה של 1000 מיקרוליטר; השתמש בעכבר מונוקלונלי IgG2b Alexa Fluor® 488 כבקרת איזוטיפ.
anti-TOMM20 מצומד עם Alexa Fluor 488	סנטה קרוז ביוטכנולוגיה	Cat# sc-17764 RRID:AB_628381	נוגדן ראשוני; השתמש כ-1:400, 2.5 מיקרוליטר בתמיסת צביעה של 1000 מיקרוליטר; השתמש בעכבר חד שבטי IgG2a Alexa Fluor® 488 כבקרת איזוטיפ.
אנטי-NDUFB10	אבקאם	ab196019	נוגדן ראשוני; השתמש כ-1:1000, 1 מיקרוליטר בתמיסת צביעה של 1000 מיקרוליטר; השתמש ב-Alexa Fluor ® 488 עז נגד ארנב IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, קטלוג # A-11008) כנוגדן משני; השתמש ב-IgG חד-שבטי של ארנב כבקרת איזוטיפ.
אנטי-SDHA	אבקאם	ab137040	נוגדן ראשוני; השתמש כ-1:1000, 1 מיקרוליטר בתמיסת צביעה של 1000 מיקרוליטר; השתמש ב-Alexa Fluor ® 488 עז נגד ארנב IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, קטלוג # A-11008) כנוגדן משני; השתמש ב-IgG חד-שבטי של ארנב כבקרת איזוטיפ.
אנטי-קוקס IV	אבקאם	ab14744, RRID:AB_301443	נוגדן ראשוני; השתמש כ-1:1000, 1 מיקרוליטר בתמיסת צביעה של 1000 מיקרוליטר; להשתמש ב-Alexa Fluor ® 488 עז נגד עכבר IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, קטלוג # A-11001) כנוגדן משני; השתמש ב-IgG חד-שבטי של עכבר כבקרת איזוטיפ.
PBS 1x	תרמו פישר סיינטיפיק	18912014	משמש לשלבי כביסה
פורמלדהיד (PFA) 16%	תרמו פישר מדעי	28908	קיבוע תאים
גליצין	סיגמא-אולדריץ'	G8898	משמש לחסימת מאגר
אלבומין סרום בקר	Europa Bioproducts	EQBAH62-1000	חומר חוסם למניעת קשירה לא ספציפית של נוגדנים במבחני צביעה חיסונית ומרכיב CDM