בדיקת לוציפראז למדידת פעילות γ-secretase בתאים אנושיים

תקציר

מקור: Wang, B., et al., מדידה כמותית של חלבון מבשר עמילואיד בתיווך γ-secretase ומחשוף חריץ בפלטפורמות בדיקת Luciferase Reporter מבוססות תאים. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים את הליך מדידת פעילות γ-secretase בתאים אנושיים מהונדסים גנטית באמצעות מערכת השראת טטרציקלין. התהליך כולל השראת ביטוי גן APP עם טטרציקלין, יצירת פפטידים β עמילואיד והפעלת ייצור לוציפראז. לאחר מכן נמדדת הביולומינסנציה הנובעת מתגובת לוציפראז-סובסטרט, המשקפת את פעילות γ-secretase.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות ה-IRB של המכון.

1. מדידת אותות מדווח לוציפראז, התואמים למחשוף γ-Secretase של APP-C99 ( חלבון מבשר עמילואיד - שבר חומצת אמינו C-terminal 99)

הערה: אנא עיין בפרסומים הקודמים לתיאורים מפורטים של יצירת תאי CG (C99-Gal4).

1. תאי CG זרעים (20,000 תאים/באר) על מיקרו-פלטות של 96 בארות בנפח סופי של 200 מיקרוליטר לבאר במצע גידול המורכב ממדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 5 מיקרוגרם/מ"ל בלסטיצידין, אנטיביוטיקה של 250 מיקרוגרם/מ"ל (, למשל, זאוצין), ו-200 מיקרוגרם/מ"ל היגרומיצין B.
   1. ספרו תאים בעזרת המוציטומטר.
   2. העבירו את המיקרו-צלחות לח לאינקובטור CO₂ ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
2. הסר 100 מיקרוליטר של מצע גידול מכל באר.
3. הוסף 100 מיקרוליטר לבאר של מצע גידול המכיל 2 מיקרוגרם/מ"ל טטרציקלין עם 0.2% דימתיל סולפוקסיד (DMSO), 2 מיקרומטר CL-387,785, 2 מיקרומטר N-[N-(3,5-דיפלואורופנצטיל-L-אלניל)]-S-פנילגליצין t-בוטילסטר (DAPT), או מעכבי ErbB1/ErbB2 קשורים אחרים.
4. דגירה של תאי CG שטופלו במיקרו-פלטות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
5. הסר 150 מיקרוליטר / מצע גידול באר מהמיקרו-פלטות.
6. הוסף 50 מיקרוליטר / באר מגיב לבדיקת לוציפראז (ראה טבלת חומרים).
7. העבר את המיקרו-לוחות לקורא מיקרו-לוחות זוהר.
   1. שמור על המיקרו-פלטות בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות עם תסיסה עדינה.
8. קבע את הזוהר הנפלט מ- Firefly luciferase (FL) באמצעות תוכנית מוגדרת מראש המאוחסנת בקורא המיקרו-לוחות הזוהר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קורא לוחות זוהר של VictorLight	פרקין אלמר	2030-0010
ארון בטיחות ביולוגי Class II, סוג 2	תרמו סיינטיפיק	1300 סדרה A2
CL-387,785	EMD Calbiochem	233100-1MG
DAPT	מרק	565770
מדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM)	תרמו פישר	12100046	המרכיב העיקרי של מדיום הגידול
סרום בקר עוברי (FBS)	תרמו פישר	16000044
Blasticidin	תרמו פישר	A1113903
זאוצין	תרמו פישר	R25005
Hygromycin B	גיבקו	10687010
המוציטומר	סיגמא-אולדריץ'	BR717805 אולדריץ'
96 בארות מיקרו-לוח	נונק	156545
טטרציקלין	סיגמא	T7660
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	סיגמא	D2650
Steady-Glo luciferase assay reagent	פרומגה	E2510
חממת CO2 לחה	רבקו	אולטימה II
שורת תאים T-REx293	Invitrogen	R71007
וולאק 1420 תוכנה גרסה 3.0	פרקין אלמר		תוכנת בקרת מכשירים של קורא המיקרו-לוחות הזוהר