אימונוהיסטוכימיה לזיהוי אזור ה-locus coeruleus בחלקי מוח של עכברים

תקציר

מקור: Schmidt, K. et al., לוקליזציה של locus coeruleus במוח העכבר. J. Vis. Exp. (2019)

פרוטוקול זה מתאר את השימוש באימונוהיסטוכימיה לזיהוי אזורי לוקוס קורולאוס במקטעי מוח של עכברים. על ידי התמקדות בדופמין β-הידרוקסילאז עם נוגדנים ירוקים המסומנים בפלואורופור, נוירונים המייצרים נוראדרנלין מוצגים כפלואורסצנטיות ירוקה תחת מיקרוסקופ.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. חיתוך מוח

1. לשתק ולהרדים עכברים על ידי מריחת איזופלורן 3%.
   1. משרים צמר גפן עם טיפות איזופלורן ומניחים אותו בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 15 מ"ל. הכניסו את האף של החיה לתוך הצינור ואפשרו לו לשאוף את האיזופלורן. בדוק את עומק ההרדמה על ידי חוסר תגובה לצביטה בבוהן.
2. הניחו את החיה על גבה ושתקו אותה על ידי הצמדת גפיה כלפי מטה עם סיכת T תוך גישה לבטנה.
3. חותכים את החיה במספריים כירורגיים, חותכים את עור הבטן וחותכים את העור באזור בית החזה. הצמד את העור כלפי מטה באמצעות סיכות T. לאחר מכן, שברו את קרום הצפק עד בית החזה. חשוף את הלב על ידי פיצוח חלל בית החזה וחיתוך הסרעפת.
4. חותכים את האטריום הימני כדי לאפשר לדם לזרום החוצה מהחיה. הכנס מזרק של 10 מ"ל עם מחט בגודל 25 לחדר השמאלי והחדיר 10 מ"ל של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS).
   הערה: זה מאפשר לתמיסה לזרום דרך סירקולציה מערכתית ולצאת דרך הפרוזדור הימני.
5. הסר את המזרק של 10 מ"ל והכנס מחט בגודל 25 המחוברת למזרק 60 מ"ל. לחלחל דרך החדר השמאלי עם 50 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד קר כקרח (PFA).
   1. הכן תמיסת PFA 4% קרה כקרח על ידי דילול תמיסת 10% PFA ב-H₂O וקירור תמיסת ה-4% PFA הסופית ב-4 מעלות צלזיוס.
6. בודד את ראש העכבר והסר את המוח מהגולגולת.
   1. חותכים את העור מהצוואר, ואז חותכים לכיוון העיניים כדי לחשוף את הגולגולת. סדקו את הגולגולת מהצוואר לאף, ואז מגלגל עין אחד לשני. מקלפים את הגולגולת החוצה וכורתים את כל המוח.
7. לדגור את המוח ב-4% PFA למשך 24 שעות ב-4 מעלות צלזיוס.
8. העבירו את המוח בעזרת מלקחיים לצינור חרוטי של 50 מ"ל מלא ב-25 מ"ל של תמיסת סוכרוז 30%. שמור אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 48-72 שעות עד שהמוח שוקע לתחתית הצינור.
9. חותכים את המוח עם מטריצת פורס מוח של עכבר בוגר דרך המוח התיכון (~3 מ"מ אחורי ברגמה). שמור על קטע המוח המכיל את גזע המוח.
   הערה: זה יביא לשני חלקי מוח - אחד המכיל את רוב קליפת המוח (החלק הקדמי של החתך) ואחד המכיל את גזע המוח/המוח הקטן (החלק האחורי של החתך). השתמש בקטע גזע המוח עבור השלבים הבאים.
10. הטמע את קטע גזע המוח עם המשטח החיתוך המונח בתחתית תבנית הטבעה, מוקף בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT); העבירו את המוח המוטבע למקפיא של -80 מעלות צלזיוס והקפיאו למשך 12 שעות לפחות - עד לשימוש נוסף.
11. חיתוך בקריוסטט: הנח את תבנית ההטבעה המכילה את המוח ב-OCT לתוך הקריוסטט; דגרו אותו בקריוסטט למשך מספר שעות כדי להתאים את הטמפרטורה של גוש המוח לזו של הקריוסטט.
12. קלף את תבנית ההטבעה כדי לחשוף את גוש ה-OCT המכיל את המוח.
13. השתמש בסכיני גילוח כדי להסיר עודפי OCT מפני השטח של הבלוק מבלי לגעת במוח.
14. הרכיבו את בלוק ה-OCT על הצ'אק של הקריוסטט, וחשפו את המשטח החתוך של המוח לכיוון הקדמי.
15. התאם את המשטח החתוך של המוח כך שהוא מכוון במקביל לסכיני הגילוח של הקריוסטט.
16. חתוך את המוח החל מהמדולה, וחתוך קטעים של 100 מיקרומטר באופן גס.
17. חתוך בחוזקה עד שהמוח הקטן וגזע המוח נחתכים כפרוסה אחת רציפה. התחל לאסוף פרוסות בעובי 50 מיקרומטר.
    הערה: כאשר מקצצים את המדולה, גזע המוח והמוח הקטן ייחתכו לשני חלקים נפרדים. בחלקים הרוסטרליים, גזע המוח והמוח הקטן יתמזגו בסופו של דבר ברמה של החדר הרביעי. ברגע שהקצוות הצדדיים של החדר הרביעי נוצרים היטב, אז המוח הקטן וגזע המוח ייצאו כפרוסה אחת רציפה.
    1. אספו פרוסת מוח מוקפת OCT עם מלקחיים, והניחו אותה בבאר של צלחת של 24 בארות מלאה ב-PBS (איור 1a). ה-locus coeruleus (LC) יהיה בולט ביותר כאשר המוח הקטן והקוליקולוס התחתון נפגשים זה עם זה ב-~-5.52 מ"מ אחורי הברגמה (איור 2b).
       הערה: החלק הקדמי ביותר של LC ייעלם ברגע שהמוח הקטן נחתך במלואו ולא יקיף יותר את הקוליקולוס התחתון ב~-5.34 מ"מ אחורי הברגמה (איור 2c).

2. אימונוהיסטוכימיה עבור דופמין β-הידרוקסילאז (DBH) או טירוזין הידרוקסילאז (TH) (איור 1)

1. יום 1
   1. שוטפים את הפרוסות שנבחרו שלוש פעמים למשך 5 דקות ב- PBS.
   2. לחלחל למשך 24 שעות בתמיסת מלח עם 0.5% פוספט עם חומר ניקוי (PBSD) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      1. מדללים 125 מיקרוליטר חומר ניקוי ב -25 מ"ל PBS.
2. יום 2
   1. שוטפים פרוסות שלוש פעמים למשך 5 דקות ב-0.5% PBSD.
   2. הוסף את הנוגדן העיקרי, anti-DBH או anti-TH, למשך 18 שעות בדילול של 1:500 ב-0.5% PBSD ב-4 מעלות צלזיוס.
3. יום 3
   1. שוטפים פרוסות שלוש פעמים למשך 10 דקות ב 0.5% PBSD.
   2. הוסף את הנוגדן המשני הרצוי (488 חמור נגד ארנב לפלואורסצנטיות ירוקה) בדילול של 1:1000 ב-0.5% PBSD למשך 16 שעות.
   3. עוטפים את צלחת 24 הבארות באלומיניום ומניחים בחום של 4 מעלות צלזיוס.
   4. שוטפים פרוסות שלוש פעמים למשך 5 דקות ב-0.5% PBSD.
   5. יש לשטוף במשך 5 דקות ב-PBS.
   6. מעבירים פרוסות בעזרת מברשת עיפרון למיכל מים.
   7. הרכיבו פרוסות צפות במים על מגלשות טעונות.
   8. חלקי כיסוי עם מדיית הרכבה קשיחה דופמין בטא-הידרוקסילאז
   9. יבש את חלקי המוח המותקנים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
   10. דמיין פרוסות מוח במיקרוסקופ קונפוקלי או פלואורסצנטי עם הגדרות לזיהוי אותות מאורך גל פלואורופור של נוגדנים משניים מתאימים.
   11. התאם את המיקרוסקופ למישור המוקד של פרוסת המוח וצלם תמונה בודדת בהגדלה של פי 10.

תוצאות

איור 1: זיהוי LC על ידי צביעה חיסונית של פרוסות מוח עבור DBH או TH. (a) מוח אחד של עכבר חולק לפרוסות של 50 מיקרומטר סביב גזע המוח ונאסף בשתי מנות של 24 בארות. כל פרוסת מוח 5 עד 8 שנאספה הורכבה על כיסוי מכוסה סרט להדמיה באמצעות XFM. פרוסות אלה מסומנות במספרים כחולים בין הבארות. פרוסות סמוכות שצפות ב-PBS היו צבועות חיסון כדי ש-DBH יזהה LC (מסומן בצלב האדום על בארות). עיגולים ירוקים מציינים פרוסות חיוב...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מטריצת פורס מוח של עכבר בוגר	Zivic Instruments	BSMAS001-1
נוגדן משני נגד ארנב, Alexa Fluor 488 (מקור - חמור)	תרמו פישר מדעי	A-21206
שקופיות זכוכית טעונות	ג'נסי	29-107
מיקרוסקופ קונפוקלי	צייס	LSM 800
קריוסטט	מיקרום GmbH	HM 505E
להבי חיתוך קריוסטט	תרמו פישר סיינטיפיק	MX35
מספריים מיני, 9.5 ס"מ	Antech Diagnostcs	503241
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	סיגמא-אולדריץ'	D9542-10MG
נוגדן דופמין β-הידרוקסילאז (DBH) - ייצור פנימי (מקור - ארנב)	ב. אייפר	-
נוגדן דופמין β-הידרוקסילאז (DBH) - זמין מסחרית (מקור - ארנב)	איתות תאים	8586
שפופרות בז, 50 מ"ל	ארה"ב מדעית	339652
פוראן (איזופלואורן)	בקסטר	NDC 1019-360-60
מלקחיים מיקרו אדסון	Antech Diagnostcs	501245
מדיית הרכבה קשיחה	EM sciences	17984-24
מיקרוסקופ	פסקל	LSM 5
צלחות מרובות בארות, 24 בארות	תרמו פישר מדעי	930186
תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT)	VWR / טכנולוגיית רקמות	102094-106
פרפורמלדהיד (PFA)/ פורמלין 10%	פישר סיינטיפיק	SF98-4
תבניות הטבעה חד פעמיות Peel-A-Way	פוליסיינסס בע"מ	18646A
מברשת עיפרון
מי מלח חוצץ פוספט (PBS)	לייף טק	14190250
סכיני גילוח	אמזון	ASIN: B000CMFJZ2
מרית	Antech Diagnostcs	14374
סיכות T	אופיס דיפו	344615
מוח העכבר בקואורדינטות סטריאוטקסיות, פקסינוס ופרנקלין, מהדורה שלישית	אמזון	מסת"ב: 978-0123694607
Triton-X 100 (להכנת PBSD)	סיגמא-אולדריץ'	T8787
Tween 20	סיגמא-אולדריץ'	P7949-500 מ"ל
נוגדן טירוזין הידרוקסילאז (TH) (מקור - ארנב)	EMD Millipore	AB152
מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב-שדה	צייס	Axio Zoom.V16