שיטה לגרימת פגיעה מוחית טראומטית בראש סגור בדרוזופילה

תקציר

מקור: Katzenberger, R. J., et al., שיטה לגרימת פגיעה מוחית טראומטית בראש סגור בDrosophila. J. Vis. Exp. (2015).

הסרטון מדגים את השימוש במכשיר טראומה בעל השפעה גבוהה (HIT) כדי לגרום לפגיעה מוחית טראומטית בראש סגור (TBI) ב-Drosophila. TBI גורמת לטראומה מוחית מכנית שמשפיעה על תפקוד תאי העצב, מה שמוביל לאורך זמן לניוון עצבי ולתמותה.

פרוטוקול

1. בניית מכשיר ה-HIT

1. חבר את הקפיץ ללוח באמצעות שני clamps וארבעה ברגים (איור 1A). מרכז את המהדקים ביחס לרוחב הלוח והטיח אותם זה בזה כשהמהדק החיצוני סומק עם קצה הלוח. לפני חיבור המהדקים, כופפו אותם בעזרת צבת כדי להתאים היטב מעל הקפיץ.
   הערה: ראה טבלה 1 לתיאורים של החומרים הדרושים לבניית התקן HIT. הקצה המהודק של הקפיץ צריך להיות 1/8 אינץ' (3.2 מ"מ) מקצה הלוח, והקצה החופשי צריך להשתרע על הלוח ב-3/4 אינץ' (19 מ"מ). כוונן את הקפיץ כך שישכב במקביל לאורך הלוח.
2. עטפו את הקצה החופשי של הקפיץ פעם אחת עם רצועת ההדבקה של לולאות הסקוטש. הקצה החיצוני של הסקוטש צריך להיות סומק עם קצה הקפיץ. הסקוטש חשוב מכיוון שהוא משמש לאבטחת הבקבוקון לקפיץ על ידי יצירת התאמת דחיסה הדוקה. הסקוטש גם מאפשר חיבור והסרה קלים של בקבוקונים, ומאפשר לעבד בקבוקונים רבים בפרק זמן קצר.
3. הנח את מכסה דלי הקרח הפוך, במרכז, הדוק ללוח העץ. כוון את האזור המוגבה של מכסה דלי הקרח כך שהקצה הארוך יהיה מקביל לרוחב הלוח. שימו לב שהאזור המוגבה של דלי הקרח גבוה ב-1/2 אינץ' (13 מ"מ) מלוח העץ, כך שכאשר בקבוקון מחובר לקפיץ הקפיץ לא ישכב שטוח על הלוח.
4. החלק את כל המכשיר על חפץ קבוע כמו קיר, כך שמכסה דלי הקרח יהיה תקוע בין הלוח לחפץ ולא יזוז.
5. הדביקו את מד זווית הנייר לתחתית מגש בקבוקון זבוב מקרטון והעמידו אותו על הקצה כנגד אורך הלוח כך שסימן 90° מיושר עם הקפיץ כאשר הוא נמשך לאחור למצב אנכי לחלוטין.

2. הפעלת התקן HIT

1. מניחים בין 1 ל-60 זבובים מורדמים CO₂ בבקבוקון ריק ועוצרים את הבקבוקון באמצעות צמר גפן הדוק.
2. הגבל את הזבובים לתחתית 1 אינץ' (2.5 ס"מ) של הבקבוקון על ידי דחיפת כדור הצמר גפן לתוך הבקבוקון עד שהוא 1 אינץ' (2.5 ס"מ) מהתחתית. כדאי לצייר קו על הבקבוקון בסימן 1 אינץ' (2.5 ס"מ). שימו לב שהגבלת זבובים לאזורים גדולים או קטנים יותר של הבקבוקון יכולה להשפיע על חומרת הפנוטיפים.
3. המתן 5 דקות עד שהזבובים ישחזרו את הניידות מה-CO₂. שים לב שלא ידוע אם 5 דקות מספיקות כדי להסיר לחלוטין את ההשפעות של CO₂.
4. הכנס את קצה הקפיץ לתוך הבקבוקון עד שהקצה הפנימי של הסקוטש מיושר עם החלק העליון של הבקבוקון (איור 1B). כאשר הקפיץ שוכב שטוח, 1 אינץ' (2.5 ס"מ) מהבקבוקון צריך לחפוף את האזור המוגבה של מכסה דלי הקרח. ניתן לעשות שימוש חוזר בבקבוקונים פעמים רבות.
5. בישיבה, החזק את הבקבוקון באזור הסקוטש באמצעות האגודל והאצבע המורה של יד שמאל. החזק את הלוח בחוזקה לספסל בעזרת יד ימין. לחלופין, השתמש ב-C-clamps כדי להחזיק את הלוח חזק לספסל.
6. משוך את הקפיץ ישר לחלוטין בחזרה לזווית הרצויה. שחרר את הקפיץ. אפשר לקפיץ לעצור לחלוטין.
7. מוציאים את הבקבוקון מהקפיץ ומאפשרים לזבובים להתאושש למשך ≥5 דקות. חשפו את הזבובים למכה נוספת או העבירו את הזבובים לבקבוקון עם מזון זבובים.
   הערה: ניתן להשתמש במגוון בדיקות כדי להעריך את ההשפעות הפנוטיפיות של מכות ממכשיר HIT. לדוגמה, ניתן לקבוע את ההשפעות על אריכות החיים על ידי ניתוח אחוז הזבובים ששורדים לפעמים לאחר פציעה, ניתן לקבוע את ההשפעות על המורפולוגיה של המוח על ידי ניתוח היסטולוגי של הראש, והשפעות על ביטוי גנים יכולות להיקבע על ידי ניתוח כמותי של רמות mRNA.
8. קבע את השפעות ההליך שאינן נובעות משביתות על ידי טיפול זהה בזבובי ביקורת שאינם נתונים לשביתות. ללבוש מגן שמיעה מכיוון שהשפעת הבקבוקון על מכסה דלי הקרח מייצרת רעש חזק.

תוצאות

איור 1: דיאגרמה של התקן HIT. (A) איור של החלק העליון view של התקן HIT במצב מנוחה. (B) איור של מבט מהצד של התקן HIT. הקפיץ מוצג במצב מנוחה (אדום כהה) ומוסט ל-90 מעלות (אדום בהיר).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קפיץ דחיסה מצופה אבץ	קבוצת הילמן	540189	9 7/8 אינץ' (אורך), 15/16 אינץ' (קוטר חיצוני), 0.12 אינץ' (גודל חוט)
לוח עץ			9 אינץ' (אורך), 6.5 אינץ' (רוחב), 0.75 אינץ' (גובה)
מלחציים	תאגיד ייצור החשמל של סיגמא	49822	3.10 אינץ' (אורך), 0.68 אינץ' (רוחב), 1.11 אינץ' (גובה), EMT רצועות שני חורים, לחץ על הסוג עבור צינור EMT מפלדה בגודל 1 אינץ'
לולאה חצי סקוטש דביק			3 אינץ' (אורך), (3/4 ברוחב)
כיסוי דלי קרח מפוליאוריתן	פישר סיינטיפיק	02-591-45	9 1/8 אינץ' (אורך), 9 1/8 אינץ' (רוחב), 1 1/4 אינץ' (גובה)
בקבוקוני זבוב מפלסטיק	מדע יישומי	AS-510	3 11/16 אינץ' (גובה), 1 1/16 אינץ' (קוטר פנימי), 1 1/8 אינץ' (קוטר חיצוני)
כדורי צמר גפן גדולים	פישר סיינטיפיק	22-456-883
מד זווית נייר			10 אינץ' (קוטר)