כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.
1. הכנת לנטי-וירוס (שלב אופציונלי)
- פיצול שלוש צלחות של 10 ס"מ של תאים HEK293T לכל לנטי-וירוס שיוצרו בנוכחות 10 מ"ל DMEM/10% FBS ויגדלו למפגש ~60-70%. לגדל תאים בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
- העבירו את פלסמידי ה-DNA הבאים (סה"כ 10 מיקרוגרם) לכל צלחת באמצעות כל מגיב טרנספקציה: 6.4 מיקרוגרם וקטור לנטי-ויראלי CAG-Flex-GFP, 1.2 מיקרוגרם pMD2.G (מקודד VSV-g), 1.2 מיקרוגרם pRSV-Rev ו-1.2 מיקרוגרם pMDLg/pRRE. שלושת וקטורי האריזה הלנטי-ויראלים זמינים מסחרית.
הערה: גישה זו משתמשת בווקטורים לנטי-ויראליים מהדור השלישי, אך גם וקטורים מהדור השני ופלסמידים נלווים יעבדו.
- הכן מיכל פסולת המכיל תמיסת אקונומיקה של 10% בתוך מכסה מנוע מוסמך BSL2 כדי להשבית כל תמיסות או מכשירים שבאו במגע או מכילים לנטי-וירוס. לאחר מכן, הסר לחלוטין את המדיה 4-6 שעות לאחר ההעברה לתמיסת האקונומיקה, החלף באותו נפח של מדיה חדשה ואפשר לתאים לגדול.
- לאחר 4 ימים, יש לאסוף את המדיה לתוך צינורות חרוטיים של 50 מ"ל וצנטריפוגה בטמפרטורה של 1,000 x גרם למשך 15 דקות כדי לגלול כל פסולת תאים. לאחר מכן, סננו את הסופרנטנט דרך ממברנה של 0.45 מיקרומטר. כל מסנן קשירת חלבון נמוך, כמו PVDF, עובד היטב. זהירות: הכניסו פסולת ויראלית מוצקה ונוזלית לתוך תמיסת האקונומיקה.
- טען 30 מ"ל סופרנטנט מסונן לתוך צינורות אולטרה-צנטריפוגה ולתוך אולטרה-צנטריפוגה. צנטריפוגה ב-100,000 x גרם למשך 2.5 שעות ב-4 מעלות צלזיוס. פתח את צינורות הצנטריפוגה במכסה מנוע BSL2 והסר את הסופרנטנט ל-10% אקונומיקה. הוסף ~100 מיקרוליטר של PBS לגלולה, מה שמניב טיטרים של 1x107 ל-1x108 יחידות זיהומיות/מ"ל. יש לאחסן למחרת בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
- שיקול חשוב: למוסדות רבים יש עכשיו ליבות ויראליות. רכוש וירוס מרוכז עם טיטר מינימלי של 1x107 יחידות זיהומיות/מ"ל, לקבלת תוצאות מיטביות.
2. עכברים תורמים לדיסקציה של MGE
- ראשית, הגדר הזדווגות מתוזמנת בין קו עניין המבטא Cre לבין עכבר מסוג פרא (WT) או עכבר שיבטא כתב לאחר רקומבינציה בתיווך Cre.
הערה: קווי Cre-driver רבים הם טרנסגניים ומתוחזקים ומגדלים במצב המיזיגוטי. לפיכך, רק מחצית מהעוברים יכילו את הטרנסגן Cre. ניתן להכין במהירות DNA מהעוברים ל-PCR קצר כדי לזהות את אלל ה-Cre. לאחר מכן ניתן לקצור את העוברים Cre+ כך שרק רקמת ה-MGE של הגנוטיפ הרצוי תשתמש. לחלופין, ניתן להשתמש במדווח תלוי Cre כדי לבחור את העוברים לדיסקציה והשתלה של MGE.
- חשב איזה יום יתאים ל- E13.5. אם בעלי חיים זווגו בערב הקודם, יום התקע הוא 0.5. הזמינו עכברים בהריון מתוזמן או נקבת WT עם גורי P1 על מנת לתזמן הולדת עכברים לאחר הלידה (P)1 ביום שבו רקמת התורם תהיה E13.5. לחלופין, הקימו את ההזדווגות הללו בבית שבוע לפני זיווג בעלי החיים התורמים.
הערה: האסטרטגיה הקודמת של יצירת עוברים/גורים E13.5 ו-P1 לאותו יום היא לעתים קרובות קשה לביצוע מהימן.
3. הכנת מדיה, כלים וציוד.
- הכן את הריאגנטים והכלים להכנת תאי MGE (טבלה 1).
- הכינו משטח נקי והניחו מלקחיים נקיים, מספריים וסכין מיקרו-כירורגית או מלקחיים עדינים (לדיסקציה מדויקת של רקמות) על פני השטח.
- הכן את תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) לדיסקציה ואת מדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM) עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) להעברה.
- דגירה מוקדמת של 20-30 מ"ל DMEM/10% FBS בחממת תרבית רקמה של 37 מעלות צלזיוס למשך כשעה. יש לשחרר את המכסה כדי לאפשר חילופי גזים ואיזון pH של המדיה.
הערה: ניתן להכין את הדגירה המוקדמת של המדיה ממש לפני תחילת הניתוח.
4. הכנת תא MGE
- הקריבו את העכברה ההרה על פי פרוטוקול מאושר לבעלי חיים והוציאו את העוברים לצלחת פטרי בגודל 10 ס"מ המכילה HBSS קר כקרח.
- הסר את המוח מכל עובר באמצעות סקופ חיתוך (עשה אחד בכל פעם, והשאיר את שאר העוברים ב-HBSS קר כקרח) ולאחר מכן המשך לחתוך את רקמת ה-MGE.
הערה: מפורט להלן ובאיור איור 1 הם שלבים עיקריים המראים כיצד להסיר את ה-MGE.
- מקמו את המוח כשצד הגחון פונה כלפי מעלה (איורים 1A, A'). הערה: זה גם בסדר שההיבט הגבי פונה כלפי מעלה. חותכים את המוח לשניים לאורך המישור הסגיטלי כדי ליצור שני חלקים. דוגמה למוח חצוי מוצגת ( איורים 1B, B'); שימו לב שההיבטים הגביים (קליפת המוח שמעליה) והגחון של המוח מכסים ומקיפים את רקמת הבולטות הגנגליונית (GE).
- לאחר מכן, עם יד דומיננטית, החזיקו מלקחיים עדינים מאוד או סכין דקירה (טבלה 1) תוך כדי שיתוק ההמיספרה עם מלקחיים המוחזקים על ידי יד לא דומיננטית. (ההיבט המדיאלי של חצי הכדור צריך להיות פונה כלפי מעלה). קפלו את רקמת הגב והגחון בעזרת מלקחיים וסכין דקירה כדי לחשוף את רקמת ה-GE הבסיסית (איור 1C ומשורטט ב-איור 1C').
הערה: הסרת חלק מהמדיה מצלחת הפטרי של הדיסקציה יכולה להקל על ייצוב הרקמה בזמן ביצוע דיסקציה של MGE.
- בצע חתכים ישרים עם סכין הדקירה או מלקחיים עדינים כדי להפריד בין רקמות ה-CGE, LGE והמחיצה (ראה דוגמה לחתכים המסומנים בקווים מקווקווים אדומים, איורים 1D ו-D'). ניתן לבצע חתכים אלה בכל סדר.
הערה: דמיינו את ה-MGE כ'קופסה' שנחתכת מהרקמה שמסביב. פעולה זו עוזרת לבצע חתכים דומים עבור כל דיסקציה, ובכך להפחית את השונות בדיסקציות רקמות.
- לבסוף, סובבו את ה-MGE על צידו וחתכו את החלק התחתון (מה היה ההיבט הצדדי של המוח). זה מסיר את אזור המעטפת של ה-MGE (השליכו ב-איורים 1E ו-1E') משאר ה-MGE. ההיבט הנותר של MGE מכיל בעיקר חלקים של אזור החדר והאזור התת-חדרי של ה-MGE, המכילים כמעט את כל תאי האב של MGE. המשך עם רקמה זו.
- שיקול חשוב: תוספת של ג'ל סיליקון לתחתית צלחת פטרי יכולה לשמש כמשטח חיתוך מצוין מכיוון שהיא מגנה על הקצוות העדינים של המלקחיים ומספקת משטח רך להצמדת רקמות עם מלקחיים.
5. תיוג והשתלה של Lentiviral
- העבר את הצינורות של רקמת MGE לתוך מכסה מנוע מאושר BSL2 והסר את המדיה.
הערה: רקמת ה-MGE גדולה מספיק כדי להיות גלויה ותשקע בתחתית הצינור, מה שיאפשר להסיר את המדיה הקרה בקלות ובעדינות.
- הוסף ~500 מיקרוליטר של מדיה DMEM/10% FBS, שהודגרה מראש בחממת תרבית רקמה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסף פוליברן כדי להקל על התמרה לכל צינור בריכוז סופי של 8 מיקרוגרם/מ"ל. שלש את רקמת ה-MGE ליצירת תרחיף תא בודד באמצעות קצה פיפטה P1000. לבסוף, הוסף ~15-20 מיקרוליטר של לנטי-וירוס מרוכז לכל צינור.
- שיקול חשוב: טריטורציה של 10-12 פעמים מספיקה כדי לפרק רקמת MGE מעובר בודד, אך ייתכן שיידרשו טריטורציות נוספות אם מספר MGEs מאוגדים יחד. נסה תנאי טריטורציה שונים כדי לקבוע מה עובד הכי טוב.
- סוגרים היטב כל צינור, הופכים לערבוב, ואז מניחים את כל הצינורות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. דגירה על התאים ב-lentivirus למשך 30 דקות לפחות ועד שעה, זמנים ארוכים יותר הביאו לירידה בכדאיות התאים. הפוך את הצינורות כל 10 דקות עד שהזמן נגמר.
- לאחר הדגירה עם lentivirus, הסר את הצינורות מהחממה והצנטריפוגה ב-~700 x g למשך 3 דקות כדי לגלול את התאים. במכסה המנוע BSL2, הסר את הסופרנטנט והשליך לתוך 10% אקונומיקה. לאחר מכן, הוסף 1 מ"ל DMEM/10% FBS ושלש את הגלולה 2-3 פעמים לשטיפה, ואז צנטריפוגה שוב באותה מהירות כדי לגלול את התאים. חזור על שלב הכביסה הזה 2-3 פעמים נוספות כדי להסיר עודפי וירוס.
הערה: בצע צעדי צנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס; עם זאת, כדאיות מופחתת לא נצפתה כאשר ספינים קצרים מבוצעים ב-RT.
- לאחר הכביסה הסופית, הסר כמה שיותר מדיה והניח כל צינור על קרח. עקב שאריות מדיה בצידי הצינור, ~2-3 מיקרוליטר של מדיה יכסו בסופו של דבר את גלולת התא עד תחילת הליך ההשתלה.
6. השתלה ואימות
- רכשו גורי P1 מארחים והכינו את אזור ההליך על ידי ריסוס עם 70% אתנול. כדי לשמור על סטריליות במהלך ההליך, מומלץ לבצע הליכים אלה בחדר נוהל נקי ייעודי. בנוסף, השתמשו בכלי ניתוח חיטוי ועקרו את המשטחים שהגורים יהיו איתם במגע, תוך שימוש ב-70% אתנול. דוגמה לציוד מייצג הדרוש לביצוע ההשתלות, ואזור פרוצדורה מייצג, מוצגת ב-איור 2.
הערה: בעוד שהליך זה הוא הזרקה של נפחים קטנים, ולא הליך כירורגי הדורש חתך, פצע פתוח או תפרים, עדיין מומלץ להשתמש במיקרופיפטה חדשה לכל עכבר שיוזרק. המיקרופיפטות עוברות עיקור בחום כאשר הן נמשכות ומשופעות על משטח שרוסס ב-70% אתנול המאוחסן במיכל אטום.
- צור מיקרופיפטות בקוטר בקצה שבין 40-80 מיקרומטר. ביצוע מידות אלה יניב תוצאות מיטביות. עקרו בחום את המיקרופיפטות כאשר הן נמשכות ומשופעות על משטח ורססו עם 70% אתנול לפני אחסון המיקרופיפטות במיכל אטום.
הערה: לחלופין, אם הגישה למכשירים הדרושים ליצירת המחטים הללו (טבלה 1) מוגבלת, השתמש בכל מכשיר הזרקה אחר. עם זאת, ייתכן שאלו לא יתאימו כמו המיקרופיפטות בשל קטרים שונים.
- שואבים שמן מינרלי למזרק של 1 מ"ל, ובעזרת מחט של 30 1/2 גרם, ממלאים את פיפטת הזכוכית לחלוטין בשמן מינרלי. לאחר מכן, התקן את הבוכנה על המכשיר הסטריאוטקסי, ולאחר מכן חבר את פיפטת הזכוכית למכשיר הסטריאוטקסי וטען אותה על הבוכנה. בעזרת הכונן ההידראולי, הזיזו את הבוכנה בערך באמצע הדרך לתוך פיפטת הזכוכית, והסירו שמן מינרלי שנשפך החוצה בעזרת מגבת נייר נקייה.
- חלופה לשימוש במזרק, טבלו את הקצה האחורי של הפיפטה בשמן מינרלי ומלאו בפעולה נימית. כדי למנוע בועות אוויר בפיפטה, שמור על לחץ חיובי על המזרק עד ליציאה מלאה מפיפטת הזכוכית.
הערה: ניתן להשתמש במכשירים אחרים כדי להשתיל בהצלחה תאי MGE. כל מכשיר שיכול לספק נפח קטן או קרוב ל-100 nl עובד היטב עבור הליך זה.
- לאחר מכן, השתמש במגבת נייר סטרילית או בכל חומר סופג, כאשר הפינה מעוותת לנקודה דקה כדי להסיר בעדינות עודפי מדיה מעל כדור תא ה-MGE. שלב זה מרכז את צפיפות התאים כך שניתן להשיג נפחי הזרקה קטנים יותר. לאחר מכן, השתמש בפיפטה בנפח נמוך (עדיף P2) כדי למשוך לאט את כדור התא ולשלש 1-2 פעמים לפני הזזת תרחיף התא על משטח הידרופובי. הנפח צריך להיות קצת פחות מ-1 מיקרוליטר. העבר את קצה המחט לתוך מתלה התא ובעזרת הכונן ההידראולי, משוך את מתלה התא לתוך הפיפטה.
- להרדים גור P1 באמצעות היפותרמיה (לעטוף בכפפת לטקס ולשים קרח למשך ~ 2-4 דקות). בדוק את יעילות ההרדמה עם גירוי מזיק. צבטו את העור בין אצבעות הרגליים בעזרת מלקחיים עדינים: הגור אמור לא להגיב אם צובטים אותו. לאחר מכן, הניחו את הגור על תבנית שנמצאת מתחת למכשיר ההזרקה, ולאחר מכן הפכו את העור למתוח על ידי משיכת העור לאחור על הראש ואבטחתו עם סרט מעבדה סטנדרטי.
הערה: בעוד שהיפותרמיה יעילה מאוד על עכברים יילודים וגורמת לשיעור תמותה נמוך, יש לבצע הליכים במהירות, מכיוון שהגורים יתחילו להתאושש תוך פחות מ-10 דקות. בנוסף, 4 דקות על קרח הן הגבול העליון של מה שניתן לסבול. נסה לגרום להיפותרמיה רק פעם אחת אם נדרש זמן ארוך יותר לזריקות. עם זאת, אם גור מתאושש מוקדם, תחילה אפשר לגור להתאושש לחלוטין לפני שיגרום שוב להיפותרמיה. יתר על כן, לגרום להיפותרמיה רק פעם נוספת לביצוע זריקות. גורים יתאוששו תוך 5-10 דקות מהיפותרמיה. ניתן להקל על כך על ידי הנחת הגורים עם המלטה ואמא או על ידי הנחת הגור על משטח חם כדי להתאושש.
- בעזרת מכשיר סטריאוטקסי, מקם את קצה פיפטת הזכוכית על פני השטח על ראש הגור, בניצב לפני השטח של הראש. כאשר הפיפטה נמצאת במגע עם הראש, התייחסו לזה כ-'0'. לאחר מכן, דחפו את הפיפטה דרך פני העור והגולגולת לתוך קליפת המוח, ואז הכניסו את הפיפטה ומשכו אותה ~ פעמיים לפני העצירה. למיקוד אופטימלי של תאים לניאו-קורטקס, הזרקות מבוצעות כאשר המיקרופיפטה נמצאת בעומק של 0.1 מ"מ. עם זאת, זה צריך להיות מותאם על ידי המשתמש (ראה הערה למטה).
הערה: בעוד שעומק זה מכוון באופן אמין לשכבות ניאו-קורטיקליות עמוקות יותר עם המכשירים שתוארו לעיל, יש לבדוק ולקבוע כמה עומקים באופן אמפירי. בנוסף, יש לבדוק מגוון עומקים במיקומים רוסטרו-זנביים ובינוניים-רוחביים שונים כדי לקבוע איזה עומק אופטימלי בכל אתר. כמו כן, הניקוב הראשוני צריך להיות מהיר, שכן חדירה איטית לניאו-קורטקס מפחיתה את היכולת לחדור בצורה נקייה לרקמה. נסה מהירויות שונות בעת התחלת הליך זה לראשונה כדי למצוא מה עובד הכי טוב. בנוסף, לבדיקת קואורדינטות, אין תחליף אמיתי לשימוש בתאים מסומנים, מכיוון שצבעים לא היו אמינים לציון מיקום.
- לאחר שהמחט נמצאת במקומה, סובב את המכשיר ההידראולי כדי לקדם את הבוכנה לתוך פיפטת הזכוכית, ודחף נפח מוגדר של מתלה תאים לתוך קליפת המוח. יש להזריק 50-70 nls לכל אתר. חזור על הליך זה ב-3-6 אתרים שונים ברמות רוסטרל-זנב שונות אם המטרה היא להשיג פיזור רחב של תאים ברחבי הניאו-קורטקס.
הערה: נפחים של 100 nl ומעלה עלולים לגרום לנגעים ולהוביל לגושים גדולים של תאים מוזרקים שאינם מצליחים לנדוד ביעילות מאתר ההזרקה. לפיכך, נפחי הזרקה קטנים יותר (~70 nl או פחות) הם אופטימליים, על פני יותר אתרים אם הזמן מאפשר.
- בסיום ההזרקות הסירו את הגור מהבמה וסמנו אותו (גזירת אצבעות היא דרך אמינה לזהות את הגורים מאוחר יותר). לאחר שהגור התאושש ומסוגל לנוע בכוחות עצמו (זה קורה תוך דקות מרגע הוצאתו מהבמה), החזירו אותו לאמא ולשגר.
הערה: מכיוון שמדובר בהליך זעיר פולשני, אין הליכים לאחר הניתוח לאחר שהגור נע ומתחמם בחופשיות. עם זאת, יש לבדוק גורים לא רק לאחר ההליך אלא גם למחרת כדי לוודא שאין להם סימנים להידרדרות בבריאותם.
- לפני תחילת ההליך על הגור הבא, רססו את האזור ב-70% אתנול כדי לשמור על אזור עבודה סטרילי. אפשרו לגורים המוזרקים להתפתח ולאחר מכן העריכו את הרקמה בשלבי ההתפתחות המתאימים.
טבלה 1. רשימת מלאי של ריאגנטים וכלים. מלאי של ריאגנטים זמינים מסחרית כולל מדיה, כלי דיסקציה, ציוד מייצג להשתלה ווקטורי DNA. (נ.א.) לא זמין או ישים.
| ריאגנטים וציוד להכנה והתמרה של תאי MGE | קטלוג # | חברה |
| 1) | מדיום הנשר המותאם של דולבקו, עם גלוקוז גבוה | 12491-015 | טכנולוגיות חיים |
| 2) | סרום בקר עוברי מושבת בחום | 10437-077 | טכנולוגיות חיים |
| 3) | תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS), ללא סידן או מגנזיום | 14170-112 | טכנולוגיות חיים |
| 4) | 1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה (או צינורות איסוף אחרים עם מכסים) | 3810X | אפנדורף אינטרנשיונל |
| 5) | פוליברן | SC-134220 | סנטה קרוז ביוטכנולוגיה |
| 6) | סכין דקירה ישר 22.5 ° (אופציונלי) | REF 72-2201 | Surgical specialities corporation |
| 7) | צלחת פטרי (10 ס"מ), לנתיחת רקמות | FB0875713 | פישר סיינטיפיק |
| 8) | 2 מלקחיים דקים, כמו Dumont #5 | 11254-20 | כלים מדעיים משובחים |
| 9) | 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 קלט | C150 | קלסר |
| 10) | צנטריפוגה שולחנית שיכולה לסובב צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל | | |
| 11) | כל פיפטה P1000 שיכולה לשמש לטריטורציה של תאים | | |
| 12) | מכסה מנוע ברמת בטיחות ביולוגית 2 | | |
| ריאגנטים וציוד לתרביות ראשוניות של MGE במבחנה | קטלוג # | חברה |
| 1) | שקופיות קאמריות Lab-TekII עם כיסוי, 8 בארות | 154941 | תרמו פישר |
| 2) | פולי-L-ליזין 0.1% משקל/נפח | P8920 | סיגמא אולדריץ' |
| 3) | למינין עכבר, 0.5-2 מ"ג/מ"ל | 23017-015 | טכנולוגיות חיים |
| 4) | מדיום נוירו-בסיסי | 21103-049 | טכנולוגיות חיים |
| 5) | תוסף תזונה ללא סרום B27 | 17504044 | טכנולוגיות חיים |
| 6) | Glutamax, מניות פי 100 | 35050-061 | טכנולוגיות חיים |
| 7) | פניצילין-סטרפטומיצין, 100x סטוק | 15070-063 | טכנולוגיות חיים |
| 8) | גלוקוז, (הכינו תמיסה של 25% במים) | G5400 | סיגמא אולדריץ' |
| ריאגנטים וציוד להשתלת תאי MGE | קטלוג # | חברה |
| 1) | מזרק 1 מ"ל | REF 309602 | BD, בקטון דיקינסון ושות' |
| 2) | 30 1/2 G מחט | 305106 | BD, בקטון דיקינסון ושות' |
| 3) | Precision bore to deliver 5 μl (comes with plunger) | 5-000-1005 | החברה המדעית של דראמונד |
| 4) | פרפילם | PM-999 | פוליסיינסס בע"מ |
| 5) ** | מיקרוסקופ סטריאו עם מעמד | MZ6 | לייקה |
| 6) ** | מכשיר סטריאוטקסי דיגיטלי רק לעכברים | 51725D | חברת סטולטינג |
| 7) ** | מיקרומניפולטור עדין שמן חד צירי | MO-10 | Narishige |
| 8) | משופע סיבובי מצופה יהלום | n.a. | תוצרת בית |
| 9) | Needle pipette puller | 730 | כלי קופף |
| 10) | שמן מינרלי | n.a. | כל בית מרקחת או בית מרקחת |
| 11) | כל פיפטה וקצוות שיכולים למדוד באופן אמין 1 מיקרוליטר של נפח | | |
| ** אלה המודלים שבהם אנו משתמשים, אבל הגדרות רבות אחרות אמורות לעבוד | |
| ריאגנטים אופציונליים (ליצירת לנטי-וירוסים) | קטלוג # | חברה |
| 1) | 25 מ"מ, מסנן 0.45 מיקרומטר | 09-719B | פישר סיינטיפיק |
| 2) | צינורות צנטריפוגות שקופים במיוחד (25 x 89 מ"מ) | 344058 | בקמן קולטר® |
| 3) | ליפופקטמין 2000 | (גודל 1.5 מ"ל) | 11668019 | Invitrogen |
| אספקה מסחרית אחרת | קטלוג # | חברה |
| 1) | pMDLg/pRRE קידוד פלסמיד gag/pol | 12251 | תוספת |
| 2) | pRSV-Rev קידוד פלסמיד Rev | 12253 | תוספת |
| 3) | pMD2.G קידוד פלסמיד VSVG | 12259 | תוספת |
| 4) | pAAV-Flex-GFP | 28304 | תוספת |
