מיקרודיאליזה של נוזל אינטרסטיציאלי ממוח עכבר לבידוד חלבונים חוץ-תאיים

תקציר

מקור: Yamada, K. In Vivo שיטת מיקרודיאליזה לאיסוף חלבונים חוץ-תאיים גדולים מנוזל ביניים במוח עם בדיקות חיתוך במשקל מולקולרי גבוה. J. Vis. Exp. (2018)

הסרטון מדגים את תהליך השימוש בבדיקת מיקרודיאליזה לאיסוף חלבונים חוץ-תאיים מהנוזל הבין-תאי (ISF) של מוח עכבר. בדיקת מיקרודיאליזה, המצוידת בקרום חדיר למחצה חתוך במשקל מולקולרי גבוה, מוחדרת למוחו של עכבר מורדם באמצעות צינורית מנחה מושתלת. הגשושית, המחוברת למשאבות, מאפשרת לחצץ פיזיולוגי לחלחל את רקמת המוח ולהתערבב עם ה-ISF. חלבונים ב-ISF מתפזרים על פני הממברנה החדירה למחצה ונאספים לניתוח.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הליך טרום ניתוחי

1. לפני תחילת הניתוח, נגב הכל עם 70% אתנול כדי לשמור על תנאים סטריליים. תמיכה תרמית באמצעות כרית חימום מומלצת.
2. להרדים את העכברים על ידי הזרקה תוך-צפקית של כלורל הידרט (400 מ"ג/ק"ג). יש לאשר את ההרדמה על ידי ביצוע צביטה בבוהן. מומלץ להשתמש במלוקסיקם SR באינדוקציה ובופרנורפין עם ההחלמה BID (bis in die, פעמיים ביום) למשך 24 שעות לפחות.
3. לגלח את השיער בעזרת קוצץ כירורגי. תקן עכבר במתאם העכבר והחולדה היילודים באמצעות מוטות אוזניים ומהדק אף.
   הערה: חשוב לוודא שראש העכבר מאובטח בשלב זה ואינו זז זה לצד זה.
4. יש למרוח משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש בזמן ההרדמה.

2. ניתוח סטריאוטקסי להשתלת צינורית מדריך

1. הגדר את מתאם העכבר והחולדה היילודים על המנגנון הסטריאוטקסי. בצע חתך סגיטלי על העור מעל הגולגולת באמצעות אזמל. נגב את הדם ואת רקמת החיבור על הגולגולת באמצעות צמר גפן לח.
2. קבע את הקואורדינטות של אזור העניין במוח באמצעות אטלס המוח. לפני תחילת המדידות, ודא שקו האמצע ישר כך שניתן יהיה להזיז את המקדח AP ולהישאר על תפר קו האמצע כל הזמן.
   הערה: מאמר זה משתמש בקואורדינטות (A/P: -3.1 מ"מ, M/L: -2.5 מ"מ, D/V: -1.2 מ"מ, 12 מעלות) כדי למקד את ההיפוקמפוס האחורי.
3. גולגולת רמה A-P
   1. חבר מקדחה על מניפולטור של מסגרת סטריאוטקסית. הורד את המקדחה עד שהיא נוגעת בעדינות בלמבדה ורשום את הקואורדינטה הגחונית שלה. חזור על הליך זה עבור ברגמה.
      הערה: כאשר הגולגולת מפולסת, המידה האנכית של ברגמה שווה לזו של למבדה. אם לא, התאם את גובה האף clamp בהתאם. לאחר שהגולגולת מפולסת, רשום את הקואורדינטות הקדמיות/אחוריות, הרוחביות של ברגמה.
4. מפלס גולגולת שמאל-ימין
   1. העבר את המקדחה מברגמה לקואורדינטה (Anteroposterior [A/P]: -3.1 מ"מ, מדיולטרלי [M/L]: +2.0 מ"מ), הורד את המקדחה לגולגולת ורשום את הקואורדינטה האנכית. לאחר מכן חזור על הליך זה עבור הקואורדינטות (A/P: -3.1 מ"מ, M/L: -2.0 מ"מ).
      הערה: אם הגולגולת מפולסת, המדידות האנכיות הללו של שתי נקודות שוות מרחק מקו האמצע שוות. אם לא, התאם את גובה מוטות האוזניים.
5. קדחו חור בור בזהירות בקואורדינטות המטרה (A/P: -3.1 מ"מ, M/L: -2.5 מ"מ) כדי להשתיל צינורית מנחה. אם קוטר חור הבור אינו גדול מספיק להשתלת צינורית מדריך, קדחו חור נוסף החופף לראשון. קדחו חור נוסף בעצם הקודקודית הימנית (הנגדית) והכניסו בורג עצם, המסייע לאבטח את המלט הדנטלי ב-1.10 (ראו איור 1B).
6. חותכים חתיכת נעילה עגולה מהצד האחורי של המכסה של צינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל על ידי סכין גילוח ויוצרים "כתר". כתר זה משמש למניעת התפשטות מלט דנטלי לעור. הניחו אותו על הגולגולת כך שחורי הקוצים שנוצרו בשלב 2.5 יישארו בתוך המעגל (ראו איור 1).
7. הגדר מכלול סטריאוטקסי על ידי הנחת צינורית מנחה על הזרוע הקצרה יותר של מתאם סטריאוטקסי והדק אותה באמצעות אום מכסה. הנח את הזרוע הארוכה יותר של המתאם הסטריאוטקסי על האלקטרודה clamp. חבר אותו על המניפולטור של המנגנון הסטריאוטקסי (ראה איור 1A).
8. סובב את מכלול הסטריאוטקס הגבי-גחוני (D-V) על זרוע המניפולטור ב-12 מעלות (ראה איור 1B). העבר את צינורית ההנחיה לחור הקוצים שנעשה ב-1.6. הכניסו את צינורית ההנחיה לאט למוח על ידי הורדתה ב-1.2 מ"מ.
   הערה: זווית הגשושית היא ספציפית להיפוקמפוס; אזורים אחרים עשויים לדרוש זוויות אחרות או ללא זווית כלל. התייעץ עם אטלס מוח לקבלת קואורדינטות מדויקות. יבש את פני הגולגולת, כי אם לא המלט לא יידבק ומכסה המלט עלול להיעקר
9. הוסף את המלט הדנטלי בתוך הכתר כדי לכסות במלואו גם את החלק המתכתי של צינורית ההנחיה וגם את בורג העצם מספיק כדי לאבטח אותם. מרחו מלט דנטלי נוסף אם יש חלק מהגולגולת חשוף.
10. המתן עד שהמלט הדנטלי יתייבש לחלוטין (~12-20 דקות). הסר את המתאם הסטריאוטקסי מהאלקטרודה clamp. הסר את אום המכסה והחלף את המתאם הסטריאוטקסי בבדיקה דמה והדק את אום המכסה.
11. שחרר את העכבר מהמנגנון הסטריאוטקסי ושכן את העכבר לבד בכלוב בודד.
    הערה: אין להשאיר את העכבר ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה על עצם החזה. בדוק את העכבר מדי יום עד ליום המיקרודיאליזה. העכבר מקבל תרופות נוגדות דלקת לא סטרואידיות (NSAIDs) כגון קרפרופן אם נראה שהוא סובל מכאבים. המתנה של שבועיים הכרחית למחקרי שינה-ערות כדי שהעכבר יתרגל לסביבה החדשה, אולם סוגים אחרים של מחקרים עשויים לדרוש תקופות התאוששות קצרות יותר ( למשל, 1-2 ימים).

3. הגדרת מיקרודיאליזה

1. בדיקת איכות של בדיקות: מלאו מזרק חד פעמי של 1 מ"ל במים מזוקקים וחברו אותו לשקע (יציאה קצרה יותר) של בדיקה באמצעות צינור ביטון. כסו את חורי האוורור באצבעות ולחצו בעדינות על בוכנת המזרק כדי להחדיר מים לבדיקה. בדוק כי מים מופיעים מכניסת הגשושית ואין דליפה על פני קרום מיקרודיאליזה.
   1. הפעלת בדיקות: טבלו את הממברנות של בדיקה באתנול (70-100%) למשך שתי שניות. לאחר מכן, החדירו שוב מים מזוקקים לתוך הגשושית בעזרת מזרק.
2. הכנת מאגר זלוף: על מנת למנוע הידבקות של מולקולות מטרה לצינורות, יש להוסיף BSA על ידי דילול תמיסת BSA של 30% ל-4% בנוזל מוחי מלאכותי (aCSF: 1.3 mM CaCl₂, 1.2 mM MgSO₄, 3 mM KCl, 0.4 mM KH₂PO₄, 25 mM NaHCO₃, 122 mM NaCl, pH=7.35), התואם באופן הדוק את ריכוז האלקטרוליטים ב-CSF, מיד לפני השימוש. סנן את מאגר הזלוף דרך יחידת מסנן מזרק בגודל נקבוביות של 0.1 מיקרומטר.
   הערה: אלבומין בסרום בקר 4% (BSA) משפר את ההתאוששות של חלבונים נדבקים אך יכול להגביל מאוד את אספקת התרכובות, במיוחד עבור תרכובות בעלות קשירת BSA גבוהה. זהו יתרון אחד של שימוש בריכוז נמוך יותר של BSA (כגון 0.15%) במקרים מסוימים. שימו לב ש-BSA יכול להצטבר בקלות רבה כאשר הוא נסער על ידי מערבולת או צלחת ערבוב. אגרגטים אלה יכולים לסתום בדיקות או נקבוביות ממברנה. יש לנקוט משנה זהירות בעת הכנת פתרון BSA כדי להגביל צבירה זו
3. הכן שני קווים נפרדים לכניסה ויציאה (ראה איור 1C) וחבר את שני הקווים עם מחט חיבור. מלאו מזרק חד פעמי של 3 מ"ל מלא במאגר זלוף וחברו אותו לקצה הכניסה של הצינור באמצעות מחט קהה. מלאו את כל הצינור במאגר זלוף על ידי הפעלת משאבת המזרק.
4. עצור את משאבת המזרק והחלף את מחט החיבור בין קו הכניסה לקו היציאה בבדיקת מיקרודיאליזה מופעלת משלב 3.3 (ראה איור 1C). לפני החלפה זו, הניחו את אגוז הכובע על הבדיקה.
5. התקן את צינור הגלילה בצינור היציאה על משאבת הגליל. הפעל את משאבת המזרק ב-10 מיקרוליטר לדקה ולאחר מכן את משאבת הגליל בקצב זרימה מעט איטי יותר (9.5-9.8 מיקרוליטר לדקה). הקפד להסיר את כל בועות האוויר בכל הצינור, מה שעלול להשפיע על ההתאוששות כאשר הן נכנסות לבדיקה.
6. הרדמו את העכבר משלב 1.12 באותו אופן כמו בשלב 1.2. שים את צווארון העכבר סביב צווארו. הסר את אום המכסה ואת בדיקת הדמה והכנס לאט בדיקת מיקרודיאליזה מ-3.4 דרך צינורית ההנחיה והדק את אום המכסה.
7. הנח את העכבר בכלוב המחובר למערכת הנעה בחופשיות וקשר את העכבר עם הצווארון. המשך להפעיל גם את משאבת המזרק וגם את משאבת הרולר בקצב הזרימה המצוין בשלב 3.5 למשך שעה אחת לפחות.
   הערה: כדי להשיג איסוף ISF מבעלי חיים ערים, מאמר זה משתמש במערכת תנועה חופשית, שבה הכלוב עצמו מגיב לתנועת החיה כדי למנוע מצינורות להתפתל. לחלופין, ניתן להשתמש גם במסתובבים נוזליים הזמינים מחברות שונות.
8. עצור תחילה את משאבת הגלילה ולאחר מכן את משאבת המזרק. הגדר את קצב הזרימה הרצוי. הפעל את משאבת המזרק ב-20% מהר יותר ממשאבת הגלילה.
   הערה: לדוגמה, אם אתה פועל במהירות של 1 מיקרוליטר לדקה, הפעל את משאבת המזרק ב-1.2 מיקרוליטר לדקה. יש לקבוע את קצב הזרימה האופטימלי באופן אמפירי עבור כל מולקולה.
9. איסוף דגימות ISF: הנח את הקצה החופשי של צינורות היציאה על אספן השברים המקורר.
   הערה: נפח הדגימה המתאים משתנה בהתאם למבחנים המשמשים לניתוח.
10. לאחר השלמת הניסוי, הסר את הגשושית. (הרדמו את העכבר לפי הצורך.)טפל בשחזור עכבר באותו אופן כמו בשלב 2.11. נתח את ה-ISF שנאסף בשיטות כגון כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) או בדיקת אימונוסורבנט מקושרת לאנזים (ELISA).
11. כדי לשטוף את כל הצינור לאחר מיקרודיאליזה, חבר שוב את צינורות הכניסה והיציאה על ידי החלפת הגשושית במחט החיבור והפעל את האקונומיקה המדוללת בכל הצינור ולאחר מכן שטוף אותה במים. יבש ואחסן אותו לשימוש חוזר.
    הערה: סוגים אחרים של צינורות מקובלים, עם זאת, BSA במאגר זלוף יכול לסתום את הצינורות בקוטר קטן, ולכן צינורות אלה נחשבים לשימוש חד פעמי. הצינורות עלולים להישחק או לסתום לאחר שימושים מרובים, לכן וודאו שקצב הזרימה עקבי בכל פעם לפני השימוש.

תוצאות

איור 1: מערך ניתוחים ובניית מעגלי מיקרודיאליזה. (א) הגדר מכלול סטריאוטקסי להשתלת מדריך באמצעות אום כובע, מתאם סטריאוטקסי וצינורית מדריך. (ב) ניתוח סטריאוטקסי להשתלת צינורית מנחה. צינורית ההנחיה מוחדרת למוח ב-12 מעלות ביחס לאנכי. (ג) בניית צינור כניסה וצינור יציאה. קו הכניסה מורכב מצינורות FEP בגודל 70 ס"מ (JF-70) וקו היציאה מורכב מ-JF-70 וצינור הגלילה ו-1/2 מצינורות ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
המיקרו-סמפלר של Univentor 820	Univentor	8303002	אספן שברים בקירור
משאבת מזרק	KD מדעי	KDS-101
משאבת רולר	מיקרו-דיאליזה של Eicom	ERP-10
מערכת עצמאית של Raturn	באסי	MD-1409	מערכת תנועה חופשית
ערכת כלוב דו-מיני	באסי	CX-1600
בדיקת מיקרודיאליזה AtmosLM (אורך פיר 8 מ"מ, אורך ממברנה 2 מ"מ)	מיקרו-דיאליזה של Eicom	PEP-8-02	אורך הפיר לבדיקה, מדריך, בדיקה דומי ומתאם סטריאוטקסי צריכים להיות זהים.
מוביל מיקרודיאליזה (אורך פיר 8 מ"מ)	מיקרו-דיאליזה של Eicom	PEG-8
בדיקת דמה מיקרודיאליזה (אורך פיר 8 מ"מ)	מיקרודיאליזה של Eicom	PED-8
בורג עצם	באסי	MD-1310
סט סופר בונד C&B	סאן מדיקל		צמנט דנטלי
מכשיר סטריאוטקסי של בעלי חיים קטנים עם קונסולת תצוגה דיגיטלית	קופף	דגם 940	מנגנון סטריאוטקסי
מתאם עכבר וחולדה יילודים	Stoelting	51625
מוטות אוזניים סטנדרטיים וקצות גומי לסטריאוטקסיק	Stoelting	51648
תמיסת אלבומין מסרום בקר	סיגמא	A7284-50ML	30% פתרון BSA
צינורות FEP (70 ס"מ)	מיקרו-דיאליזה של Eicom	JF-10-70	נפח פנימי = 0.5 μL/cm
צינורות טפלון (50 ס"מ)	מיקרו-דיאליזה של Eicom	JT-10-50	נפח פנימי = 0.08 μL/cm
צינור בייטון	מיקרו-דיאליזה של Eicom	JB-30
Intramedic luer stab adaptor 23G	BD	427565	מחט קצה קהה
צינור רולר	מיקרו-דיאליזה של Eicom	RT-5S	נפח פנימי = 4 μL
אגוז כובע	מיקרו-דיאליזה של Eicom	AC-5
0.25 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה עם כובע	QSP	503-Q	שפופרות לאספן שברים
מתאם סטרוטקסי (אורך פיר 8 מ"מ)	מיקרו-דיאליזה של Eicom	PESG-8
מחט חיבור	מיקרו-דיאליזה של Eicom	RTJ
צווארון בעלי חיים של עכבר	באסי	MD-1365
ערכת מיקרו-מנוע סיבובי במהירות גבוהה	פורדום	K.1070	תרגיל
פיקרוטוקסין	סיגמא	P1675
מברג לברגי עצם
אזמל
צמר גפן
קוצץ כירורגי