מודל פלישת גידול מבוסס מטריקס באמצעות תרבית משותפת של מיקרוגליה גליובלסטומה

תקציר

מקור: Coniglio, S., et al. בדיקות קוקולטורה לחקר גירוי מקרופאגים ומיקרוגליה של פלישת גליובלסטומה. J. Vis. Exp. (2016)

בסרטון זה, תאי גליובלסטומה ומיקרוגליה מעורבבים עם תמיסת מטריצת פולימר ומועברים להכנסת תא נקבובית שבה נוצר ג'ל, ומטמיעים את התאים. מיקרוגליה מעוררת את נדידת תאי הגליובלסטומה דרך התוספת הנקבובית, מחקה פלישת תאי גידול לרקמה שמסביב, לאחר מכן התאים מקובעים ומוכנים לניתוח נוסף.

פרוטוקול

1. תיוג פלואורסצנטי של תאים

הערה: סמן קווי תאי גליובלסטומה ומיקרוגליה בצבעים פלואורסצנטיים 9. לחלופין, ליצור קווי תאים המבטאים באופן מכונן חלבונים פלואורסצנטיים כגון GFP/RFP.

1. תאי צלחת על צלחת 6 בארות כך שהם יהיו מתכנסים 70 - 80% ביום הצביעה. עבור קו תאי גליובלסטומה של עכברים GL261 וקו תאי גליובלסטומה אנושי U87, לוח 1 x 10⁶ ו-1.5 x 10⁶, בהתאמה, על צלחת של 6 ס"מ 24 שעות לפני הצביעה.
2. הכן תמיסת צבע כתמים של תאים פלואורסצנטיים ב-DMSO (דימתיל סולפוקסיד) והוסף צבע של 5 מיקרומטר למדיה, מדיום מכון רוזוול פארק ממוריאל (RPMI) או מדיום ללא סרום מקרופאגים (MSFM), מערבולת היטב.
3. דגירה של תאים עם צבע למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂.
4. הסר חומר המכיל צבע והוסף מדיה טרייה (RPMI או MSFM) לתאים.
5. דגירה של תאים למשך 30 דקות. הערה: התאים מוכתמים כעת ומוכנים לשימוש בניסוי.

2. בדיקת פלישה "תלת מימדית" - הטמעת גליומה ומקרופאגים/מיקרוגליה במטריקס

1. יש להפשיר את תערובת המטריצה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. בצע את כל המניפולציות הנוספות באמצעות מטריצה על קרח במכסה המנוע.
2. הכן ריכוז של 10 מ"ג/מ"ל של מטריצה במדיה (MSFM או RPMI) עם 0.3% BSA על קרח.
   הערה: ריכוז המלאי של המטריצה הוא בדרך כלל בסביבות 15 מ"ג/מ"ל.
3. כדי להכין תאים (מסומנים בשלב 1) להשעיה במטריצה, הסר מדיה מהתאים על ידי שאיפה. שטפו תאים על צלחת עם 2 מ"מ EDTA (חומצה אתילנדיאמין טטראצטית)/PBS (תמיסת מלח עם חוצץ פוספט). הוסף 500 מיקרוליטר של 2 מ"מ EDTA/PBS לתאים ודגר במשך 5 - 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂.
4. השהה מחדש תאים ב-5 מ"ל של מדיה המכילה 0.3% BSA.
5. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-120 x גרם.
6. שאפו את הסופרנטנט מהגלולה. השהה מחדש את הגלולה במדיה/0.3% BSA כך שריכוז התאים שווה ל-1 x 10⁶ תאים/מ"ל. השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את התאים.
7. הוסף 1.5 x 10⁵ תאי GL261 (ב-150 מיקרוליטר) + 5 x 10⁴ תאי מיקרוגליה (ב-50 מיקרוליטר) לתוך שפופרת מיקרופוגה של 1.5 מ"ל. הוסף 2 x 10⁵ תאי GL261 (200 מיקרוליטר) לתוך שפופרת מיקרופוגה נפרדת של 1.5 מ"ל.
   הערה: תאי GL261 לבדם ללא מיקרוגליה משמשים כבקרה.
8. סובב תאים במיקרופוגה למשך 5 דקות ב-120 x גרם.
9. השעיה מחדש של תאים במטריצה קרה של 200 מיקרוליטר על קרח.
10. צלחת 50 מיקרוליטר (50,000 תאים) על מרכז התא העליון של תא בגודל נקבוביות של 8 מיקרומטר.
11. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להתרחש פילמור.
12. הוסף מדיום נטול סרום של 200 מיקרוליטר לתא העליון ומדיום גידול תאים המכיל סרום של 700 מיקרוליטר לבאר התחתונה.
13. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ למשך 48 שעות.
14. לאחר הדגירה, הסר תאים מהחלק העליון של החדר על ידי שאיפה עדינה וקבע תאים על ידי הנחתם בפורמלדהיד 3.7% ב-PBS. אפשר לתאים להישאר בקיבוע למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (או לילה ב-4 מעלות צלזיוס). הסר את הקיבוע על ידי שאיפה עדינה והחלף ב-500 מיקרוליטר 1x PBS. המשך לסעיף 4 לניתוח תמונה.

תוצאות

איור 1: סכמטי של שני פרוטוקולים שונים לבדיקת פלישת תאי גליובלסטומה מגורה על ידי מיקרוגליה/מקרופאגים. הפאנל העליון ממחיש את בדיקת פלישת תא המטריצה המצופה מראש. הפאנל התחתון ממחיש בדיקת פלישת מטריצה תלת מימדית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תא פלישת מטריגל של Corning BioCoat: With BD Matrigel Matrix	קורנינג/פישר סיינטיפיק	קטלוג: 354481
חומר ללא סרום מקרופאגים (MSFM) (500 מ"ל)	טכנולוגיות חיים	12065-074
CellTracker צבע CMTPX אדום	טכנולוגיות חיים/בדיקות מולקולריות	C34552
CellTracker צבע CMFDA ירוק	טכנולוגיות חיים/בדיקות מולקולריות	C2925
שורת תאים GL261	המכון הלאומי לסרטן (NCI)
שורת תאים THP-1	אוסף תרביות רקמות אמריקאיות	ATCC TIB-202
RPMI 1640 בינוני (500 מ"ל)	Life Technologies/Gibco	11875-093
תמיסת פורמלדהיד	סיגמא אולדריץ'	F1635
קורנינג Transwell מוסיף תרבית תאים ממברנה פוליקרבונט (נקבוביות 8 מיקרומטר) 48 לחבילה.	קורנינג	CLS3422
Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear	Trevigen	3445-005-01
סרום עגל עוברי (FBS)	טכנולוגיות חיים	קטלוג: 10500064
אלבומין סרום בקר, שבר V, טיפול בהלם חום	Fisherscientific	BP1600-100
0.5 מיליון EDTA	תרמו-פישר סיינטיפיק	15575-020