זיהום בנגיף הזיקה של תאי גזע עצביים עובריים

תקציר

מקור: McGrath, E. L., et al., זיהום בנגיף הזיקה של תאי גזע עצביים במוח עוברי אנושי מתורבתים לניתוח אימונוציטוכימי. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים הליך להדבקת תאי גזע עצביים עובריים אנושיים בנגיף זיקה. התאים הנגועים יכולים לשמש למחקרים נוספים.

פרוטוקול

1. זיהום בנגיף זיקה

הערה: ZIKV רגיש מאוד לטמפרטורה, ולכן הכרחי לאחסן את מלאי ZIKV בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס ולהימנע ממחזורי הקפאה/הפשרה. המשיכו לעבוד על קרח.

1. תאי מעבר. יש צורך ב-3-4 מיליון תאים בסך הכל כדי לזרוע צלחת של 24 בארות, לכן בעת המעבר, הכניסו את מספר התאים הדרושים לזיהום ולזריעה בבקבוק בעת המעבר.
2. אם זורעים תאים לצלחת של 24 בארות לצביעה, הכינו את הצלחת [מצפים את הבארות המכילות החלקות כיסוי ב-0.01% פולי-D-ליזין (PDL) במים סטריליים ודוגרים למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס. לצלחת של 24 בארות, השתמש ב-250 מיקרוליטר PDL לבאר].
3. לאחר המעבר, הנח 1 מ"ל של תרחיף תאים לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל, וצנטריפוגה ב-200 x גרם בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. לאחר מכן הסר את הסופרנטנט על ידי שאיפה.
4. השעו מחדש את גלולת התאים במלאי ZIKV כדי לרכוש ריבוי זיהום (MOI) של 1 עד 10. נפח תמיסת ZIKV לא יעלה על 0.5 מ"ל. לטיפול מדומה (תאי בקרה), השעו מחדש תאים באותו נפח וסוג של מדיום המשמש במלאי ZIKW.
5. דגירה מעל תערובת תאים/ZIKV בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. הפוך את הצינור 2-3 פעמים, ולאחר מכן תערובת צנטריפוגה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 216 x גרם בטמפרטורת החדר לקבלת כדור תא. השעו שוב את הגלולה ב-dPBS ובצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-216 x גרם בטמפרטורת החדר.
6. הסר את הסופרנטנט על ידי שאיפה, השהה מחדש תאים עם מדיום מתאים והעמיס תאים נגועים לתוך בקבוק או צלחת הדרושים לניסוי. אם זורעים את התאים לצלחת של 24 בארות, השעו מחדש את הגלולה ב -12 מ"ל של מדיום מתאים, ולאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטר תרחיף לכל באר.
   הערה: בשלב זה יש לשמור על התאים במצע גידול כדי לצפות בהשפעות של ZIKV על תאי גזע, או לעבור לשלבים 6 או 7 כדי לחקור את השפעת ZIKV על תהליך ההתמיינות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM	גיבקו	11965-092
F12	גיבקו	11765-054
גלוקוז (10%)	סיגמא	G8644
HEPES (1M)	קורנינג/סלגרו	25-060-c1
Pen Strep (100x)	גיבקו	15140-122
חממת פחמן דו חמצני	תרמו פורמה	Model# 3110
צנטריפוגה	תרמו פישר מדעי	75004221
ארון בטיחות ביולוגית	Forma scientific Claas II A/B3	Model# 1284
פולי-די-ליזין הידרוברומיד(PDL)	סיגמא	P6407-5MG
למינין	Invitrogen	23017-015