גירוי של נוירונים חושיים של גנגליון שורש הגב באמצעות אגוניסט לקולטן נוירופפטיד

תקציר

מקור: Lin, Y., et al., בידוד גרעיני שורש הגב ותרבית ראשונית לחקר שחרור נוירוטרנסמיטורים. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים את השימוש בתאי גנגליון שורש גבי שעברו טרנספטציה כדי לחקור שחרור נוירוטרנסמיטר על ידי גירויים עם אגוניסט קולטן נוירופפטיד.

פרוטוקול

1. שחרור נוירוטרנסמיטורים מתאי DRG ראשוניים

1. ביום השישי, לאחר ציפוי התאים (72 שעות לאחר טרנספקציה של siRNA), שנו את מדיום התרבית למדיום נטול סרום של 200 מיקרוליטר ודגרו על התאים בחממה של 37 מעלות צלזיוס CO₂ למשך 30 דקות.
2. הוסף כימיקלים לגירוי של 1 מיקרוליטר וערבב בעדינות את המדיה על ידי פיפטינג. דגרו את המנה בחממה של 37 מעלות צלזיוס CO₂ למשך הזמן המיועד.
   הערה: במאמר זה, התאים המתורבתים עוררו עם אגוניסט NPFFR2, dNPA (D.Asn-Pro-(N-Me)Ala-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg- Phe-NH2, 5 ננומול), למשך שעה אחת.
3. אסוף את מצע התרבות מצלחת התרבות והצנטריפוגה ב-5,000 x g למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להסיר זיהומים מרחפים.
4. אסוף את הסופרנטנט מהצנטריפוגה ודלל את הדגימות במי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) לפי הצורך. לאחר מכן, השתמש בערכות בדיקה חיסונית של אנזים (EIA) כדי לבדוק את רמות המוליכים העצביים.
   הערה: כאן, הסופרנטנטים דוללו ב-1:100 לפני ניתוח רמת ה-CGRP. הסופרנטנט לא דולל לפני ניתוח רמת ה-SP.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM-F12	Invitrogen	12400024	מדיום תרבות
תמיסת המלח המאוזנת של האנק	Invitrogen	14170-112	מדיום תרבות
Pasteur pipette	הילגנברג	3150102	טריטורציה של תאים
dNPA	סינתזה גנמית	לא ישים	אגוניסט NPFFR2