מאמר שיטה

חקר גלגול לימפוציטים על פני חד-שכבת תא אנדותל מיקרו-וסקולרי

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Schulte-Mecklenbeck, A., et al., ניתוח של אקסטרוואזציה של לימפוציטים באמצעות מודל במבחנה של מחסום הדם-מוח האנושי. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים חקירה ניסויית של גלגול לימפוציטים על פני מודל אנדותל מחסום דם-מוח (BBB). חד-שכבה של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח האנושי (HBMECs) נוצרת במבחנה, ותאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) המכילים לימפוציטים מתווספים לשכבה החד-שכבתית. לאחר מכן התאים מודגרים כדי לאפשר גלגול לימפוציטים, והתאים הנודדים מכומתים באמצעות ציטומטריית זרימה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת תוספות תרבית התאים

  1. ציפוי של תוספות תרבית תאים
    הערה חשובה: הימנע מלגעת בקרום של תוספות תרבית התאים.
    1. הוסף תמיסת פיברונקטין של 100 מיקרוליטר לכל תוספת תרבית תאים (איור 1A) ובאר אחת של צלחת תחתונה שטוחה של 96 בארות (באר בקרה אופטית). יש לדגור לפחות 3 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה שואבים תמיסת פיברונקטין
    2. הוסף תרחיף HBMEC של 100 מיקרוליטר לתוספות תרבית התאים ולבאר הבקרה האופטית. הוסף 600 מיקרוליטר מדיום בינוני-בסיסי של תאי אנדותל (ECM-b) לתא התחתון של תוספות תרבית התאים. דגירה במשך 3 - 4 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס / 5% CO2 עד להשגת שלמות המחסום (איור 1B), בדוק את צמיחת התאים על ידי הערכה מיקרוסקופית של HBMEC בבאר הבקרה האופטית.
      הערה: צמיחת תאים מעבר לארבעה ימים אינה מומלצת.

2. בדיקת הגירה

  1. הכנת תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMC).
    1. הוסף מדיום של 10 מ"ל מכון רוזוול פארק ממוריאל (RPMI) לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל והוסף תוסף B27 של 200 מיקרוליטר. ספרו תאי PBMC וצנטריפוגה ב -300 x גרם למשך 5 דקות. השעו מחדש את PBMC לריכוז סופי של 5 x 106 תאים/מ"ל RPMI/B27.
  2. הגדרת בדיקת ההעברה
    1. מדיום שאיבה מהתא התחתון ואחריו התא העליון של תוספות תרבית תאים המכילות חד-שכבות HBMEC קונפלואנט (איור 1A). לכל תורם להוסיף תרחיף PBMC של 100 מיקרוליטר כל אחד לתוספות תרבית התאים וגם לבאר אחת של צלחת של 24 בארות לכל ( במבחנה בקרה).
    2. הוסף 600 מיקרוליטר RPMI/B27 לתא התחתון של תוספות תרבית התאים ו-500 מיקרוליטר ל-PBMC של בקרת במבחנה ודגירה 6 שעות ב-37 מעלות צלזיוס / 5% CO2.
  3. קציר PBMC שהועבר
    1. הוציאו את תוספת תרבית התאים בעזרת מלקחיים ושטפו בזהירות את התחתית עם 400 מיקרוליטר מלח חוצץ פוספט (PBS) מבלי לגעת בקרום. השלך את תוספת תרבית התאים.
    2. הוסף פלואורוספירות ספירת זרימה של 20 מיקרוליטר (כ-1,000 חרוזים/מיקרוליטר) לתא התחתון של תוספת תרבית התא וכן לבקרת במבחנה וערבב היטב. העבר 1 מ"ל של תרחיף PBMC שנוצר לצינורות ציטומטריה זורמים.

3. ציטומטריית זרימה

  1. הכנת מדגם
    1. צנטריפוגה PBMC ב -300 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. הכן תמיסת נוגדנים על ידי הוספת נוגדנים מצומדים פלואורוכרום למאגר ציטומטריית זרימה של 100 מיקרוליטר (PBS/1% אלבומין בסרום בקר [BSA]/2 מ"מ חומצה אתילנדיאמינטטראצטית [EDTA]) לכל דגימה. עבור התוצאות המוצגות להלן נעשה שימוש ב-1 מיקרוליטר CD4-FITC (אשכול התמיינות 4-פלואורסצאין איזותיוציאנט), 1 מיקרוליטר CD3-PerCP/Cy5.5 (חלבון פרידינין כלורופיל/ציאנין 5. 5), 1 מיקרוליטר CD56-PC7 (פיקואריתרין ציאנין 7), 1 מיקרוליטר CD8-A700 (Alexa fluor 700) ו-1 מיקרוליטר CD16-A750 (Alexa fluor 750), לכל דגימה.
    3. יש להשהות מחדש PBMC ב-100 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדנים ולדגור למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    4. הוסף מאגר ציטומטריה זרימה של 250 מיקרוליטר וצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
איור 1: הגירה דיפרנציאלית של תת-קבוצות של תאי NK על פני חד-שכבות HBMEC לא מודלקות ומודלקות. א.תמונה של תוספות טרנסוול (משמאל) ואיור של מערך הניסוי (מימין). ב. אימות של פונקציות מחסום HBMEC. משמאל: צביעה אימונוהיסטוכימית של מולקולת הצומת ההדוק ZO-1 באמצעות זונולה אנטי-אנושית של ארנב אוקלודנס-1 (ZO-1, abcam, 1:200) ואימונוגלובולין אנטי-ארנב G/ציאנין 3 (IgG-Cy3, 1:300) על HBMEC שתורבת במש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
PBSגיבקו14190-094ללא CaCl2 או MgCl2
פיברונקטין 1 מ"ג/מ"לסיגמאF1141-5MG מפלזמת בקר
HBMECתא מדע1000
HBMECפלוביוטקPB-H-6023
ECM-bתא מדע1001-b
FBSScienCell1001-b
פניצילין/סטרפטומיציןתא מדע1001-b
תוסף לצמיחת תאי אנדותלתא מדע1001-b
טרנסוולקורנינג3472ברור, קוטר 6.5 מ"מ, גודל נקבוביות 3.0 מיקרומטר
96 צלחת תחתונה שטוחהקורנינג3596
B27גיבקו17504-04450x מרוכז
צלחת 48 בארותקורנינג3526
RPMI 1640גיבקו61870-010
ספירת זרימה פלואורוספירהבקמן קולטר7547053
Na-EDTAסיגמאE5134
BSAסיגמאA2153
CD3-perCP/Cy5.5ביו-אגדה300430clone UCHT1
CD56-PC7בקמן קולטרA21692clone N901
CD16-A750בקמן קולטרA66330clone 3G8
CD4-FITCביו-אגדה300506שיבוט RPA-T4
CD8-A700בקמן קולטרA66332clone B9.11

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Transwell

מאמרים קשורים