מדידת אזור האוטם ובצקת מוחית במוח חולדה לאחר חסימת עורק המוח האמצעי

תקציר

מקור: Frank, D., et al. מדידת בצקת מוחית לאחר שבץ מוחי, אזור האוטם והתמוטטות מחסום דם-מוח בקבוצה אחת של דגימות מוח של מכרסמים. J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מדגים את הערכת אזור האוטם ובצקת המוח בפרוסות מוח מחולדות שהיו נתונות לחסימת עורק המוח האמצעי. אזורים עם אוטם מזוהים באמצעות צביעת חמצון חיזור, בעוד שמסנן כחול ופונקציית סף בתוכנת ניתוח תמונה מכמתים את אזור האוטם והבצקת בחצי הכדור הפגוע.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבחינת אתיקה של בעלי חיים.

1. קביעת אזור האוטם

1. מדוד את אזור האוטם (IZ) לאחר 24 שעות לאחר חסימת עורק המוח האמצעי (MCAO).
   הערה: חולדות שאיבדו יותר מ-20% ממשקלן או פיתחו התקפים או המיפלגיה אינן נכללות בניסוי.
2. המתת חסד של החולדה על ידי החלפת תערובת הגזים בהשראת 20% חמצן ו-80% פחמן דו חמצני עד שהחולדה מפסיקה לנשום באופן ספונטני.
3. פתח את החזה עם חתך רוחבי של 5-6 ס"מ דרך דופן הבטן מתחת לכלוב הצלעות באמצעות מספריים ומלקחיים כירורגיים.
4. בצע חתך סרעפתי לכל אורך כלוב הצלעות בעזרת מספריים ומלקחיים כירורגיים.
5. עקרו בזהירות את הריאות, חתכו את כלוב הצלעות עד עצם הבריח בצד ימין ושמאל.
6. החדרה עם 200 מ"ל של מי מלח רגילים דרך החדר השמאלי של הלב.
7. לנקב או לחתוך את הפרוזדור הימני של הלב במספריים.
8. בצע עריפת ראש באמצעות גיליוטינה ואסוף רקמת מוח.
9. בעזרת מספריים לקשתית העין חותכים מהנקב מגנום לקצה הדיסטלי של משטח הגולגולת האחורי משני הצדדים.
10. הפרד את נורות הריח, הקשרים העצביים לאורך פני הגחון ומשטח הגב של הגולגולת מהמוח.
11. הסר את המוח מהראש.
12. צור 6 פרוסות מוח על ידי יצירת חתכים אופקיים בעובי 2 מ"מ עם סכין גילוח נירוסטה 0.009 אינץ', לא מצופה, קצה יחיד.
13. יש לדגור למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-0.05% TTC.
14. הניחו את רקמת המוח על שקופיות המיקרוסקופ ובצעו סריקה אופטית של 6 פרוסות המוח האלה ברזולוציה של 1600x1600 dpi (ראו איור 1 למשל).
15. הוסיפו מסנן כחול עם עורך תמונות (לדוגמה, Adobe Photoshop CS2) באמצעות הפונקציה Channel Mixer (Image > Adjustments >-Channel Mixer) ושמרו את התמונה כפורמט קובץ JPEG.
    הערה: לאחר החלת המסנן הכחול, התמונה תופיע בגווני אפור.
16. פתח את התמונה השמורה ב-ImageJ 1.37v.
    הערה: תוכנת מחשב זו משתמשת בפונקציית סף כדי לבודד ולחשב את הפיקסלים השחורים או הלבנים (ראה איור 2).
17. עבור כל אחת מ-6 פרוסות המוח של התמונה, בחר ושמור כל המיספרה (ימין פצוע מקביל ושמאל לא פגוע) כקובץ תמונה נפרד באמצעות הכלי "בחירת מצולעים" מהתפריט הראשי.
18. הגדר את החתך לקביעת IZ על ידי שימוש בפונקציית סף אוטומטי מהתפריט הראשי של תוכנת ImageJ על ידי בחירה ב-Image > Adjust > Threshold ומדוד את מספר הפיקסלים בכל המיספרה של ערכת מוח אחת.
    הערה: ניתן להשתמש בפקודות מאקרו לשלב זה בתוכנת ImageJ (ראה מסמך משלים 1 לקוד). החיתוך הוא פרמטר קריטי לקביעת אילו פיקסלים להמיר ללבן ואילו להמיר לשחור בהתאם לגוון האפור (ראה איור 3 ו- איור 4 כדוגמאות). לאחר מכן, ImageJ משווה פיקסלים לבנים ושחורים כדי לקבוע IZ. בהתבסס על פרוטוקול הצביעה והגדרות הסורק, השתמשנו בערך חיתוך קבוע של 0.220.
19. בצע מדידה של תיקון IZ לנפיחות ברקמות באמצעות שיטת Ratios of Ipsilateral and Contralateral Cerebral Hemispheres (RICH) (ראה דוגמה ב-איור 5).
    
    הערה: גודל האוטם מוערך כאחוז מחצי הכדור הנגדי.

2. קביעת בצקת מוחית

הערה: השתמש ב-ImageJ 1.37v למדידת בצקת מוחית (BE).

1. מדוד BE 24 שעות לאחר MCAO. לחישוב BE, השתמש בנתונים מנפח ההמיספרה השמאלית והימנית (ביחידות).
2. בצע סריקה אופטית ברזולוציה של 1600x1600 dpi (ראה איור 1 לדוגמה).
3. בחר חצאי מוח והגדר את החתך לקביעת BE עם ImageJ 1.37v, כמתואר לעיל בסעיפים 1.17-1.19.
4. בטא את שטח ה-BE כאחוז מהאזורים הסטנדרטיים של ההמיספרה הנגדית הבלתי מושפעת, המחושב בשיטת RICH באמצעות המשוואה הבאה (ראה דוגמה ב-איור 5).
   
   הערה: היקף ה-BE מוערך כאחוז מההמיספרה הנגדית.

תוצאות

איור 1: דוגמה לסריקה של פרוסות מוח.

איור 2: פרוסות מוח מייצגות של חולדות שעברו ניתוח דמה וחולדות MCAO.

(א-ב) תמונה סרוקה מקורית. (ג-ד) טרנספורמציה לגווני אפור. (א-ג) פונקציית סף. (ג-ה) יישום פילטר כחול. (I-J) פונקציית סף ל...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מטריצות מוח ורקמות	סיגמא-אולדריץ'	15013
סורק אופטי	קנון	סריקת קאנו 4200F	רזולוציה 3200 x 6400 dpi
צלחות פטרי	סיגמא-אולדריץ'	P5606
להבי אזמל #11	סיגמא-אולדריץ'	S2771
תוכנה
Adobe Photoshop CS2 עבור Windows	אדובי
ImageJ 1.37v	NIH		קוד המקור זמין בחינם. המחבר, וויין רסבנד (wayne@codon.nih.gov), נמצא בענף שירותי המחקר, המכון הלאומי לבריאות הנפש, בת'סדה, מרילנד, ארה"ב
Office 365 ProPlus	מיקרוסופט	-	מיקרוסופט אופיס אקסל
Windows 10	מיקרוסופט
ריאגנטים
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	סיגמא-אולדריץ'	298-96-4
כחול אוונס 2%	סיגמא-אולדריץ'	314-13-6