הערכת התנגדות חשמלית טרנסאנדותל במודל מחסום דם-מוח במבחנה

תקציר

מקור: Kuzmanov, I., et al. מודל במבחנה של מחסום הדם-מוח באמצעות ספקטרוסקופיה של עכבה: התמקדות באינטראקציה בין תאי T לתאי אנדותל. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים שיטה להערכת התנגדות חשמלית טרנסאנדותל (TEER) בתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח עכבר במבחנה. ערך TEER גבוה מצביע על צמתים שלמים של תאי אנדותל, בעוד שתוספת של תאי T מופעלים מורידה את ערך ה-TEER, ומשקפת שיבוש של מחסום הצומת.

פרוטוקול

1. הגדרה וביצוע מדידת התנגדות חשמלית טרנסאנדותל (TEER)

1. הנח את מודול 24 הבארות של מכשיר ההתנגדות החשמלית הטרנסאנדותל (TEER) מתחת למכסה הזרימה הלמינרית. הסר את המכסים והנח תוספות עם תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים במוח העכבר (MBMECs) במכשיר באמצעות מלקחיים.
2. פיפטה 810 מיקרוליטר של מדיום טרי לתא התחתון של בארות המודול: הוסף אותו בזהירות בין התוספת לקיר המודול היטב.
3. סגור את המכסים והנח את המכשיר בחממה. חבר את המכשיר למחשב שלו; הפעל את בקר המכשיר ופתח את התוכנה.
4. בחרו 'מדידה חדשה' בחלון המוקפץ. סמן את התיבות 'הצג TEER' ו'הצג Ccl'; לאחר מכן לחץ על 'התחל'. לאחר השלמת המדידה הראשונה, בחר 'בדוק את כל הבארות' בכרטיסייה 'תוצאות' כדי לראות את כל ערכי הקיבול של TEER ושכבת התא (Ccl).
5. שמור את הקובץ: קובץ>שמור בשם>' שם הקובץ שלך'.
   הערה: מכיוון ש-TEER ו-Ccl נמדדים באופן רציף בצורה אוטומטית, עקוב אחר הערכים שלהם לאורך תקופה של שלושה עד חמישה ימים. שינוי המדיום אינו הכרחי אלא אם כן כדאיות התא אינה אופטימלית, כפי שניתן לראות על ידי היעדר עלייה ב-TEER.
6. בחר את נקודת הזמן לתרבית משותפת של MBMECs עם תאי T כאשר Ccl יציב ונמוך מ-1 μF/cm² ו-TEER הגיע לרמתו המקסימלית.
7. בדוק בזהירות ערכי TEER ו-Ccl מוחלטים והוצא את הבארות שבהן MBMECs לא פיתחו חד-שכבות מתכנסות מספיק על ידי ביטול הבדיקה של בארות כאלה.
8. קבץ את שאר הבארות: לחץ לחיצה ימנית על באר ובחר 'הוסף באר לבאר ממוצעת חדשה'. תן לו שם בחלון המוקפץ; עשה את אותו הדבר עבור כל הבארות הבודדות שיש לקבץ.
9. בדוק את כל הבארות הממוצעות כדי לוודא שלכולן יש את אותם התנאים ההתחלתיים לפני התרבות המשותפת. אם לחלקם יש ערכי TEER מוחלטים או שיפועי TEER שונים באופן משמעותי, או ששגיאות התקן גדולות מדי, בצע שוב את הקיבוץ.
   הערה: הקיבוץ האופטימלי של בארות מספק שונות מינימלית בערכי TEER בתוך ובין קבוצות ניסוי.
10. בלשונית 'ניסוי' יש ללחוץ על 'השהה', לנתק את המכשיר ולהוציא אותו מהחממה. הסר את המכסים מתחת למכסה המנוע הלמינר.
11. הכן תאי T מופעלים מראש ו/או נאיביים, עם או בלי ציטוקינים ספציפיים, נוגדנים או חומרים אחרים, לפי הצורך. לדוגמה, ערבבו נוגדן אינטרפרון-גמא נגד עכברים (IFN-γ) מטוהרים/אנדוטוקסינים נמוכים (NA/LE) (שיבוט XGM1.2) עם תאי T מוכנים ב-20 מיקרוגרם/מ"ל לבאר של מכשיר ה-TEER.
    הערה: אם משתמשים בחומרים כגון מעכב גרנזים B, הם מתווספים לתרבית תאי T בתחילת גירוי תאי T: למשל, מעכב גרנזים B II (Calbiochem) מעורבב עם תאי T מבודדים בריכוז סופי של 10 מיקרומטר בדימתיל סולפוקסיד (DMSO).
12. הסר חלק מהמדיה מהתוסף (תא הבאר העליון). דוגמה: פיפטה בזהירות 150 מיקרוליטר (יש להימנע מהסרת כל המדיום מכיוון שהוא עלול להפריע לחד-שכבת MBMEC).
13. הוסף תאי T ל-MBMECs על ידי פיפטינג זהיר של 150 מיקרוליטר של מדיום המכיל 2 x 10⁵ תאים/הוספה.
    הערה: בעת קצירת תאי T שהופעלו מראש, ספור רק תאים נטולי טריפאן כחול.
14. סגור את המכסים והנח את המכשיר בחזרה בחממה. חבר מחדש את המכשיר ולחץ על 'המשך מדידה'. לאחר 24 שעות, לחץ על 'עצור' בלשונית 'ניסוי' ושמור את הקובץ (קובץ>שמור).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
cellZscope	nanoAnalytics GmbH	www.nanoanalytics.com	כולל: מודול תא 24 בארות, בקר, מחשב עם תוכנת cellZscope v2.2.2
מוסיף קרום טרנסוול - גודל נקבוביות 0.4 מיקרומטר	קורנינג	3470	למדידת TEER כקריאה ראשית
תוספות ממברנה טרנסוול - גודל נקבוביות 3 מיקרומטר	קורנינג	3472	למדידת TEER כבקרת איכות לפני בדיקת העברת תאי T
צלחת תרבית תאים 24 בארות	גריינר	650 180	תחתית שטוחה; עבור תרבות MBMEC
צלחת תרבית תאים 96 בארות	כוכב	3526	תחתון עגול; לתרבית תאים חיסונית
תא ספירת נויבאואר	מרינפלד	MF-0640010	לספירת תאים
קולגן מסוג IV משליה אנושית	סיגמא	C5533	לפתרון ציפוי MBMEC
פיברונקטין מפלזמת בקר	סיגמא	F1141-5MG	לפתרון ציפוי MBMEC
DMEM (+ GlutaMAX)	גיבקו	31966-021	לבידוד MBMEC ומדיום תרבות MBMEC
פניצילין/סטרפטומיצין	סיגמא	P4333	לבידוד MBMEC ומדיום תרבות MBMEC
הפרין	סיגמא	H3393	למדיום התרבות MBMEC
גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי אנושי (bFGF)	פפרוטק	100-18B	עבור מדיום תרבות MBMEC
IMDM + 1% L-Glutamin	גיבקו	21980-032	עבור מדיום תרבית תאי T
עכבר רקומביננטי IFN-γ	פפרוטק	315-05	עבור מבחני העברה של תאי T
עכבר רקומביננטי TNF-α	פפרוטק	315-01A	עבור מבחני העברה של תאי T
NA/LE מטוהר נגד עכברים IFN-γ נוגדן	BD Biosciences	554408	clone XMG1.2; ריכוז סופי מומלץ: 20 מיקרוגרם/מ"ל
מעכב גראנזימה B II	קלביוכם	368055	ריכוז סופי מומלץ: 10 מיקרומטר
נוגדן CD4 נגד עכברים PE	ביו-אגדה	116005	שיבוט RM4-4; לניתוח של העברת תאי T
Trypan Blue solution, 0.4%	תרמו פישר סיינטיפיק	15250061	לספירת תאים