צביעה אימונוהיסטוכימית של סיבי עצב בגרעין הבסיסי של מיינר במוח העכבר

תקציר

מקור: Singh, P., et al. אומדן סטריאולוגי של אורך הסיבים הכולינרגיים בגרעין הבזאליס של מיינרט של מוח העכבר. J. Vis. exp. (2020)

סרטון זה מדגים את הצביעה האימונוהיסטוכימית של סיבים כולינרגיים בגרעין הבסיסי של אזור מיינרט של מקטעי מוח של עכבר. הקטעים נחסמים ומטופלים בראשוני כנגד כולין אצטילטרנספראז, ואחריו נוגדנים משניים ביוטיניליים. מתווספים קומפלקסים של אבידין-ביוטין-פרוקסידאז, הנקשרים לנוגדנים משניים, ואחריהם המצע הכרומוגני. לאחר מכן החלקים מיובשים ומורכבים לפני ההדמיה מתחת למיקרוסקופ.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבחינת אתיקה של בעלי חיים.

1. זלוף ועיבוד רקמות

1. להרדים עכברים באמצעות זריקה תוך צפקית עם קטמין (100 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג). צבט את אצבעות הרגליים כדי לאשר חוסר תגובה לפני שתמשיך.
2. החדרה טרנס-קרדיאלית עם ~50 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת פוספט של 0.1M Dulbecco (DPBS) ואחריה 4% פרפורמלדהיד (PFA) במאגר פוספט 0.1M (PB).
   זהירות: PFA רעיל. השתמש בציוד מגן אישי (PPE) בעת עבודה עם PFA.
3. הסר את המוחות וטבול אותם ב-4% PFA ב-0.1 M PB ב-4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לאחר הקיבוע. שטפו עם DPBS 3x.
4. החלף לתמיסת סוכרוז של 15% ב-0.1 DPBS למשך הלילה ולאחר מכן תמיסת סוכרוז של 30% ב-0.1 M DPBS למשך 48 שעות נוספות ב-4 מעלות צלזיוס.
5. מוציאים את הרקמה מתמיסת הסוכרוז ומקפיאים בתא קריוטום מוגדר מראש לטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. ניתן לאחסן דגימות קפואות בצינורות אטומים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לחתך.
6. הטמיעו רקמות במדיום הטמעה בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (ראה טבלת חומרים) ומורכבות על דיסק דגימה. חותכים חלקים סדרתיים בעובי 30 מיקרומטר במישור עטרה באמצעות קריוטום ואוספים את כל החלקים כתוצאה מכך ב-24 צלחות תרבית באר מלאות בתמיסת קריופרוטקטנט (30% גליצרול, 30% אתילן גליקול, 40% DPBS; איור 1A-C). מאחסנים במקפיא של -20 מעלות צלזיוס.
   הערה: קטעים עבים יותר (למשל, 50 מיקרומטר) עדיפים כאשר הדבר אפשרי. ודא שהחלקים נשמרים בסדר חיתוך ושכל החלקים נמצאים לחלוטין בהקפאה. צלחת 96 באר יכולה לשמש כחלופה לצלחות 24 באר לאיסוף חלקים.
7. מכסים את הבארות באיטום צלחות למניעת אידוי וייבוש. אחסן צלחות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. קטעים המאוחסנים ב-20 מעלות צלזיוס יציבים למשך מספר חודשים עבור אימונוהיסטוכימיה של כולין אצטיל טרנספראז (ChAT).

2. בחירת חתך שיטתי עבור IHC

הערה: יש לבצע מחקר פיילוט כדי לדעת את המספר הכולל של הסעיפים הנדרשים להשגת מקדם שגיאה מקובל (CE). ערך CE הוא ביטוי לכמות השגיאה הכוללת בהליך הדגימה. הערך הנמוך ביותר מייצג את השגיאה המינימלית, וערך CE נמוך מ-0.1 נחשב מקובל על ידי התוכנה המשמשת כאן (ראה טבלת חומרים).

1. זהה את החלקים הראשונים והאחרונים עבור כל מוח על ידי השוואת מאפיינים מורפולוגיים עם אטלס מוח עכבר סטנדרטי כגון פרנקלין ופקסינוס. גרעין בזאליס של מיינרט או NBM מתחיל בברגמה -0.0 מ"מ ומסתיים ב-1.6 מ"מ. לכן, כ-50 סעיפים מכילים NBM. המספר הכולל של החלקים הוא אחד הפרמטרים הנדרשים במהלך הסטריאולוגיה. הבחירה של כל קטע 8 (SSF = 1/8) נתנה בסך הכל 6-7 חלקים לניתוח והניבה CE מקובל הן להערכת נפח והן להערכת אורך הסיבים במחקר הפיילוט שלנו.
2. התחילו באופן אקראי עם אחד משמונת החלקים הראשונים ולאחר מכן דגמו באופן שיטתי כל קטע 8 עד לחלק האחורי האחרון המכיל NBM (איור 1C).

3. אימונוהיסטוכימיה

1. העבירו את החלקים השמורים בהקפאה לטמפרטורת החדר ב-cryoprotectant ולאחר מכן 0.1M מאגר פוספט (PB) ב-6 צלחות באר.
2. שטפו 3x ב-PB.
3. דגירה ב-0.3% H₂O₂ במתנול למשך 15 דקות.
4. יש לשטוף 3 פעמים בתמיסת מלח עם Tris-buffered (TBS).
5. דגירה ב-0.25% Triton X-100 ב-TBS למשך 30 דקות.
6. יש לחסום עם 10% סרום בקר רגיל (NBS) ב-0.1% Triton X-100 ב-TBS למשך 30 דקות.
7. דגירה עם דילול של 1:1,000 של נוגדנים ראשוניים אנטי-אנושיים ChAT של עזים (ראה טבלת חומרים) ב-TBS עם 0.1% טריטון X-100 ו-1% NBS למשך 48 שעות ב-4 מעלות צלזיוס.
8. שוטפים 3 פעמים ב-TBS בטמפרטורת החדר. בצע את כל הדגירה והכביסה הנוספת בטמפרטורת החדר.
9. דגירה עם נוגדן משני נגד עזים בקר ביוטיניליזציה (ראה טבלת חומרים) למשך שעה.
10. יש לשטוף 3 פעמים ב-TBS.
11. דגירה עם קומפלקס אבידין-ביוטין-פרוקסידאז (ראה טבלת חומרים).
12. יש לשטוף 3 פעמים ב-TBS.
13. פיתוח באמצעות תמיסת מצע DAB פרוקסידאז משופרת (ראה טבלת חומרים) בהתאם להמלצות היצרן.
    זהירות: DAB חשוד כמסרטן. הוא רעיל במגע ובשאיפה. השתמש ב-PPE בעת עבודה עם DAB.
14. שטפו את החלק כמה פעמים במים מזוקקים ושמרו ב-Tris pH = 7.6.
15. הרכיבו את החלקים על השקופיות הג'לטיניות. ניתן לשים את כל החלקים מרקמה אחת על אותה שקופית. יבש את החלקים באוויר, יבש פעמיים למשך 5 דקות כל אחד עם 70%, 90%, 95% ו-100% אתנול, ולאחר מכן נקה את החלקים בשתי שטיפות קסילן של 10 דקות. כסה את החלקים באמצעות אמצעי הרכבה (ראה טבלת חומרים).
    הערה: זמן העיבוד של התייבשות ופינוי משפיע על עובי החלקים. לכן, יש להשתמש באותם תנאים עבור כל הסעיפים. במחקר הנוכחי, הערך הממוצע לעובי הסופי היה 21.11 ± 0.45 מיקרומטר.
16. שמור את החלקים במכסה האדים לייבוש. החלקים היבשים מוכנים לסטריאולוגיה.

תוצאות

איור 1: איור של עיבוד ודגימת רקמות ששימשו במחקר הנוכחי. הכנת דגימה ודגימה. (A) המוח הקטן ופקעת הריח מוסרים לפני ההרכבה על דיסק הדגימה. (B) כיוון המוח על דיסק הדגימה לחיתוך חתך. חתך אורכי רדוד (מסומן בקו) בהמיספרה אחת עוזר לזהות את צד המוח במקטעים. (C) תרשים סכמטי של לוח של 24 בארות המציג את הבחירה השיטתית של כל קטע 8 מלוח 24 הבארות (מסומן כ-'X'). (D) תרשים סכמטי של חתכים עטרתיים התוחמים את גבולות NBM...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ערכת ABC	מעבדות וקטור	PK6100
נוגדן נגד ChAT	מיליפופר, מסצ'וסטס, ארה"ב	AB144P
בקר נגד עז IgG-B	סנטה-קרוז ביוטכנולוגיה	SC-2347
סרום בקר, מבוגר	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב	B9433
קריוסטט	Lieca Microsystems, באפלו גרוב, אילינוי, ארה"ב
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב	D5652
אתילן גליקול	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב	324558
גליצרול	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב	G2025
מי חמצן	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב	H1009
ערכת Immpact-DAB	מעבדות וקטור	SK4105	פתרון מצע DAB פרוקסידאז משופר
קטמין	ווסטוורד פרמצבטיקה, ניו ג'רזי, ארה"ב	0143-9509-01
מיקרוסקופ	Lieca Microsystems, באפלו גרוב, אילינוי, ארה"ב	AF6000	מצויד בבמה ממונעת ובמצלמה דיגיטלית צבעונית IMI-tech
טמפרטורת חיתוך אופטימלית (O.C.T.) מדיום הטמעה	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית, פנסילבניה, ארה"ב	62550-12
פרפורמלדהיד	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב	P6148
אמצעי הרכבה פרמאונט	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית, פנסילבניה, ארה"ב	17986-01
טריטון X-100	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב	T8787
בסיס טריזמה	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב	T1503	טריס בסיס
טריזמה הידרוכלוריד	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב	T5941	טריס הידרוכלוריד
קסילזין	באייר, לברקוזן, גרמניה	רומפון
קסילנים, דרגה היסטולוגית	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי	534056