$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. ספיגת דופמין סינפטוזומלי
הערה: פרוטוקול זה מיועד להערכה מקבילה של שני מוחות, אך ניתן להשתמש בו בהצלחה גם לביצוע ניסויי קליטת דופמין סינפטוזומלי (DA) עם ארבעה מוחות במקביל.
- ההכנות
- סמן 48 צינורות מיקרו-צנטריפוגות 1.5 מ"ל לכל טבלה 1 (24 לכל מוח). השתמשו בצבעים שונים עבור הצינורות ששייכים לכל מוח כדי למנוע בלבול בין הדגימות.
- תווית 51 צינורות נצנוץ #1-51.
- יש להניח מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) על קרח. זה ישמש כדי לשמור על מוח קר.
- הפעל את הצנטריפוגה כדי לאפשר לה להתקרר מראש ל -4 מעלות צלזיוס.
- שקלו מראש שני צינורות מיקרו-צנטריפוגה כדי לקבל את משקל הרקמה המדויק במהלך ההכנה הסינפטוזומלית (סעיף 2.6).
- הכן מאגר הומוגניזציה על ידי ערבוב של 4 מ"מ HEPES ו-0.32 מ' סוכרוז. התאם את ה-pH ל-7.4 והמשיך על הקרח.
הערה: ניתן לשמור את מאגר ההומוגניזציה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס ולהפשיר ביום הניסוי.
- הכן את מאגר הספיגה על ידי שילוב הדברים הבאים: 25 מ"מ HEPES, 120 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 1.2 מ"מ CaCl2, 1.2 מ"מ MgSO4, 1 מ"מ חומצה אסקורבית (0.194 גרם/ליטר), 5 מ"מ D-גלוקוז (0.991 גרם/ליטר). התאם את ה-pH ל-7.4 עם NaOH (מוביל לריכוז נתרן של כ-130 מ"מ) והשאר על קרח.
הערה: עבור 2 מוחות, הכינו מאגר קליטה של 1500 מ"ל. הכינו את מאגר הספיגה כתמיסת מלאי פי 10 ללא חומצה אסקורבית וגלוקוז שנשמר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הכינו תמיסת עבודה 1x טרי ביום, בתוספת חומצה אסקורבית וגלוקוז. התאם את ה-pH עם NaOH ל-7.4.
- הכן מאגר קליטה + ליגנד על ידי שילוב הדברים הבאים: 25 מ"מ HEPES, 120 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 1.2 מ"מ CaCl2, 1.2 מ"מ MgSO4, 1 מ"מ חומצה אסקורבית (0.194 גרם/ליטר), 5 מ"מ D-גלוקוז (0.991 גרם/ליטר), 1 מיקרומטר פרגילין, 100 ננומטר דזיפרמין, 10 ננומטר מעכב Catechol-O-methyl-transferase (COMT). התאימו ל-pH 7.4 עם NaOH והמשיכו על הקרח.
הערה: השתמש במאגר קליטה של 50 מ"ל והוסף ליגנד. פרגיל מתווסף כדי לסייע במניעת פירוק של DA על ידי חמצון באמצעות מונואמין אוקסידאז (MAO). מעכב COMT (RO-41-0960) מתווסף כדי למנוע פירוק של DA (קטכולאמינים באופן כללי) באמצעות COMT. דזיפרמין מתווסף כדי לעכב את הספיגה דרך מובילי הנוראדרנלין והסרוטונין, ובכך להפוך את תוצאות הספיגה לספציפיות לטרנספורטר דופמין (DAT).
- הכן מאגר ספיגה + ליגנד + קוקאין (coc) על ידי שילוב הדברים הבאים: 25 מ"מ HEPES, 120 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 1.2 מ"מ CaCl2, 1.2 מ"מ MgSO4, 1 מ"מ חומצה אסקורבית (0.194 גרם/ליטר), 5 מ"מ D-גלוקוז (0.991 גרם/ליטר), 1 מיקרומטר פרגילין, 100 ננומטר דזיפרמין, 10 ננומטר מעכב COMT, 500 מיקרומטר קוקאין. התאימו את ה-pH ל-7.4 עם NaOH והמשיכו על הקרח.
הערה: השתמש במאגר ספיגה של 7 מ"ל + ליגנד והוסף קוקאין. קוקאין מתווסף כדי לקבל מדידת רקע של קליטת DA לא ספציפית כדי להפחית מהנתונים, ומשאיר רק את הספיגה הספציפית ל-DAT (מכיוון ש-SERT ו-NET מעוכבים על ידי דזיפרמין, כמתואר לעיל). לחלופין, ניתן להשתמש במקום זאת במעכב DAT חזק וספציפי GBR-12935.
חשוב: שמור הכל על הקרח מעתה והלאה.
- הכנה סינפטוזומלית
- הקריבו עכבר אחד בכל פעם על ידי פריקת צוואר הרחם ועריפת ראש.
- חותכים את העור בעזרת מספריים כדי לחשוף את הגולגולת וחותכים את כל הרקמות האחוריות העודפות של הגולגולת שנותרו מעריפת הראש. חותכים את הגולגולת במספריים ישרים קטנים לאורך ה-sutura sagittalis, ובסופו של דבר קדמית ככל האפשר.
- הניחו את שני קצות המספריים בכל עין של העכבר וחתכו את הגולגולת כדי להסיר את שארית הגולגולת ואת המוח השלם. הסר במהירות את המוח והנח אותו ב-PBS קר כקרח. זה ישמור עליו קר בזמן שהמוח השני מנותח.
- בעזרת מטריצת מוח, נתחו פרוסה עטרתית של 3 מ"מ של הסטריאטום (קדמי-אחורי: +1.5 מ"מ עד -1.5 מ"מ), ואחריה חתך עדין יותר עם אגרוף. ראה איור 1 לאזור האגרוף.
- שמור את הטישו על הקרח כל הזמן קדימה.
- מעבירים את הרקמה לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל לשקילה.
הערה: משקל זה ישמש בשלב 1.2.14.
- חזור על שלבים 1.2.1-1.2.6 עבור המוח השני.
- לאחר קבלת המשקל עבור שני המוח, העבירו את הרקמה לזכוכית הומוגניזציה המכילה 1 מ"ל של מאגר הומוגניזציה קר כקרח.
- הומוגניזציה של הרקמה באמצעות עלי מונע ב-800 סל"ד, 10 משיכות אחידות.
הערה: מהלך אחד שווה פעולה אחת למעלה ולמטה. המהלך הראשון צריך להיות בערך 5 שניות, 3-4 שניות הבאות. הומוגניזציה בתווך איזוטוני חשובה למניעת התפוצצות של הסינפטוזומים. שימוש בכוח מתאים ובתווך איזוטוני יאפשר למסופים הפרה-סינפטיים לאטום מחדש את הציטופלזמה הסוגרת, השלפוחיות הסינפטיות, המיטוכונדריה והשלד הציטולוגי.
- העבירו את ההומוגנאט לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל ואספו את ההומוגנאט שנותר מזכוכית ההומוגניזציה על ידי שטיפתו עם מאגר הומוגניזציה נוסף של 0.5 מ"ל.
- שמור את הדגימה על קרח בזמן שהרקמה מהמוח השני הומוגנית. הפעל את שני המוחות במקביל בשלבים 1.2.12-1.2.13.
- גלולה את הגרעינים ואת פסולת התאים על ידי צנטריפוגה (1,000 x גרם, 10 דקות, 4 מעלות צלזיוס).
- העבירו את הסופרנטנט (S1) (המכיל ממברנות תאים וציטופלזמה) לצינורות מיקרו-צנטריפוגה חדשים של 1.5 מ"ל וצנטריפוגה ב-16,000 x גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
- השליכו את הסופרנטנט (המכיל ציטופלזמה) והשעו מחדש את הגלולה (P2) (המכילה סינפטוזומים גולמיים) ברקמת מאגר הומוגניזציה של 40 מיקרוליטר / מ"ג (בהתבסס על המשקל שהתקבל בשלב 1.2.6). השעו בעדינות את השבר הסינפטוזומלי הגולמי עם פיפטה p1000, מכיוון שכוח רב מדי ישבור את הסינפטוזומים.
הערה: חשוב להגיע ל-280 מיקרוליטר לפחות. אם לא, יהיה צורך לדלל ביותר מ-40 מיקרוליטר למ"ג. שלבים 1.2.1-1.2.13 חייבים להתבצע מהר ככל האפשר, ויש לשמור על הכל על הקרח. ברגע שהסינפטוזומים הגולמיים מושעים מחדש במאגר הומוגניזציה, הם יציבים למדי כל עוד הם נשמרים על קרח.
2. ניסוי קליטה
- הוסף מאגר קליטה של 440 מיקרוליטר + ליגנד + קוקאין ל-12 צינורות המיקרו-צנטריפוגה המיועדים של 1.5 מ"ל ומאגר קליטה של 440 מיקרוליטר + ליגנד ל-36 צינורות המיקרו-צנטריפוגה הנותרים של 1.5 מ"ל (ראה טבלה 1 לפריסה).
הערה: הסר אותם מהקרח 15 דקות לפני תחילת הניסוי כדי להביא אותם לטמפרטורת החדר אך השאר על הקרח עד אז כדי לשמר מעכבים.
- הכן עקומת רוויה (דופמין (2, 5, 6-[3H]-DA) (3-H דופמין) (91.1 Ci/mmol) בריכוזים סופיים שונים (0.031, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5 ו-1.0 מיקרומטר)).
- סמן שישה צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 2 מ"ל כ-10, 5, 2.5, 1.25, 0.62 ו-0.31.
- הוסף מאגר קליטה של 750 מיקרוליטר + ליגנד ל-5 צינורות המיקרו-צנטריפוגה עם המספר הנמוך ביותר.
- הוסף 1,455.4 מיקרוליטר מאגר קליטה + ליגנד, 14.6 מיקרוליטר דופמין (1 מ"מ), 30 מיקרוליטר 3-H דופמין (11 מיקרומטר) לצינור המסומן 10.
- מעבירים 750 מיקרוליטר מהצינור המסומן 10 לצינור המסומן 5. מערבבים היטב ומעבירים 750 מיקרוליטר מהצינור הזה לצינור 2.5. חזור על דילול זה עם הצינורות הנותרים.
- שטפו מראש את מסנני המיקרופייבר מזכוכית עם מאגר קליטה של 4 מ"ל לאחר הנחתם על דלי סינון של 12 בארות.
- הוסף 10 מיקרוליטר של תרחיף הממברנה הסינפטוזומלית ל-24 צינורות המיקרו-צנטריפוגה הראשונים של 1.5 מ"ל (ראה טבלה 1 לפריסה) המכילים מאגר של 440 מיקרוליטר. מערבולת בזהירות וסובב מטה תוך זמן קצר כדי להבטיח שהסינפטוזומים שקועים במאגר. השאירו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוסלמשך 10 דקות< >
הערה: חשוב לדייק בזמנים במהלך ניסוי הקליטה להשוואה הוגנת בין מוחות. השתמש בשעון עצר לדיוק.
- הוסף 50 מיקרוליטר דופמין בריכוזים 10 ו-5 מיקרומטר (סעיף 2.2) לשתי העמודות הראשונות והשאיר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוסלמשך 5 דקות עם טלטול. לאחר 5 דקות בדיוק, עצור את התגובה על ידי הוספת מאגר קליטה קר של 1 מ"ל. עשו את אותו הדבר עם ריכוזים 2.5 ו-1.25 מיקרומטר (סעיף 2.2) ולאחר מכן עם ריכוזים 0.62 ו-0.31 מיקרומטר.
- הוסף את הדגימות למסנני המיקרופייבר השטופים מראש ושטוף עם מאגר קליטה קר של 5 x 4 מ"ל. לאחר הוספת 12 הדגימות הראשונות למסננים, העבר את המסננים לצינורות נצנוץ. חזור על כך עם 12 הדוגמאות הבאות.
- חזרו על שלבים 2.4-2.6 עבור המוח הבא.
- הכן 3 צינורות ספירה מקסימלית על ידי הנחת מסנן מיקרופייבר בתחתית צינורות הנצנוץ 49-51 והוספת 25 מיקרוליטר מריכוז הדופמין המרבי למעלה (10 מיקרומטר).
- השאירו את כל 51 צינורות הנצנוץ במכסה אדים למשך שעה.
- יש להוסיף 3 מ"ל נוזל נצנוץ לכל צינור נצנוץ ולנער במרץ על שייקר למשך שעה.
- ספרו [3H]-DA במונה בטא למשך דקה אחת.
- פתח את התוכנית ובחר: תווית: H-3, צלחת/מסנן: בקבוקון 4 מ"ל, 4 על 6, סוג בדיקה: רגיל וזמן ספירה: 1 דקה
הערה: ניתן לבצע שלב זה למחרת אם נוח יותר. השאירו דגימות מכוסות בנייר כסף למשך הלילה.
- קביעת חלבון
- השתמש בערכת בדיקת חלבון BCA סטנדרטית כדי לקבוע את ריכוזי החלבון של הסינפטוזומים להתאמות מספירות לדקה (cpm) ל-fmol/min/μg ולהשוואה נכונה של ספיגה בין דגימות.
3. ניתוח נתונים
- השתמש בנתונים מניסוי הקליטה כדי ליצור עקומת רוויה עבור כל קבוצה ולחשב את קצב התגובה (Vmax) ואת קבוע מיכאליס מנטן (KM).
הערה: ערך ה-KM משקף את ריכוז המצע הנדרש כדי להגיע למחציתה-V המקסימלי. בהתאם לכך, Vmax משקף ישירות את הפונקציה של DAT (יכולת קליטה מקסימלית), התלויה במספר ה-DAT על פני השטח ובאופן שבו פעילותו עשויה להיות מווסתת על ידי שינויים לאחר תרגום ו/או חלבונים המקיימים אינטראקציה, כמו גם על שינויים בשיפועי יונים. ערך ה-KM הוא מדד עקיף לזיקה למצע עבור הטרנספורטר אשר, חשוב מכך, ניתן גם לווסת על ידי שינויים לאחר התרגום ו/או חלבונים המקיימים אינטראקציה. כדי להעריך באופן מלא שינויים תפקודיים, חשוב אפוא לקבוע ישירות את רמות ביטוי פני השטח על ידי, למשל, בדיקת ביוטינילציה של פני השטח.
טבלה 1: פריסת צינור מיקרו-צנטריפוגה להכנה סינפטוזומלית.
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.62 | 0.31 |
| 10+קוק | 5+קוק | 2.5+קוק | 1.25+קוק | 0.62+קוק | 0.31 + קוק |
