תיוג של אינטרנוירונים מלאים בביוציטין בפרוסות היפוקמפוס של חולדות לצורך הדמיה

תקציר

מקור: Economides, G., et al. התאוששות ביוציטין ושחזורים תלת-ממדיים של אינטרנוירונים CA2 בהיפוקמפוס מלאים. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים את ההליך לצביעה של פרוסות מוח קבועות של חולדות המכילות אינטרנוירונים מלאים בביוציטין. הפרוטוקול כולל דגירה עם קומפלקס אבידין-ביוטין (ABC), צביעה עם HRP ומצע כרומוגני, שימור מבנים עם אוסמיום טטרוקסיד והטמעת הרקמה בשרף להדמיה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבחינת אתיקה של בעלי חיים

1. קביעת חלבון קושר סידן או תכולת חלבון של אינטרנוירונים והדמיית ביוציטין לאחר רישומים אלקטרופיזיולוגיים ומילוי ביוציטין

הערה: בתום הרישום האלקטרופיזיולוגי, פרוסות המכילות תאים מלאים בביוציטין מקובעות למשך הלילה לפני הליכים היסטולוגיים. התמיסה המקבעת תוחלף בהחלפה בודדת של 0.1 M מאגר פוספט למחרת בבוקר אם שאר ההליך יבוצע ביום אחר על מנת למנוע נזק לרקמות. יש להכין את תמיסת הקיבוע (4% פרפורמלדהיד, 0.2% תמיסת חומצה פיקרית רוויה, 0.025% תמיסת גלוטראלדהיד במאגר פוספט 0.1 M (PB)) ביום ההקלטות לקבלת התוצאות הטובות ביותר.

1. בסוף הרישום האלקטרופיזיולוגי, הרימו בזהירות את הפרוסה המכילה את התאים המוקלטים בעזרת מכחול והניחו אותה בסיר המכיל נוזל מוחי מלאכותי (ACSF).
   הערה: פרטים על הפרוטוקול המשמש להכנת פרוסות והקלטות תוך תאיות באמצעות אלקטרודות חדות תוארו בעבר.
2. במכסה אדים, הרימו בזהירות את פרוסת המוח בעזרת מכחול וגלגלו אותה על פיסת נייר פילטר קטנה ואיכותית. מניחים פיסת נייר סינון לח נוספת על הפרוסה ומניחים את שתי חתיכות נייר הסינון הרטוב בסיר פלסטיק קטן המכיל 5-10 מ"ל תמיסת קיבוע ושומרים במקרר למשך הלילה בחום של 4 מעלות צלזיוס.
3. הכינו תמיסה של ג'לטין במים מזוקקים. מניחים 20 מ"ל מים מזוקקים בכוס על פלטה חמה ומחממים אותה ל-60 מעלות צלזיוס. מוסיפים בהדרגה 2.4 גרם ג'לטין למים, ממתינים עד להמסה ומניחים להם להתקרר ל-35-40 מעלות צלזיוס לפני השימוש כדי למנוע נזק לרקמות.
4. החלף את תמיסת הקיבוע ב-2 מ"ל של 0.1 M PB. מניחים את הפרוסה בצלחת פטרי וחותכים את כל הרקמות העודפות בעזרת להב אזמל. מניחים את הרקמה הגזומה בצלחת פטרי (קוטר 9 ס"מ, גובה 1.4 ס"מ), מוודאים שהיא שוכבת שטוחה ללא קפלים או קמטים, ומסירים את המאגר העודף בעזרת מברשת צבע יבשה.
5. מכסים את הטישו בתמיסת הג'לטין החמה ומניחים את צלחת הפטרי על גוש קפוא כדי לקרר במהירות את התמיסה.
6. השתמשו במנורת זווית יציבה כדי לספק ניגודיות, הסתכלו דרך דופן הכלי ושמרו על הפרוסה שטוחה באמצעות לחץ קל ממכחול עדין עד שהג'לטין מתחיל להתייצב.
   הערה: ניתן להמיס את הג'לטין מחדש אם הרקמה אינה שוכבת שטוחה. ניתן להסיר כל פגמים על פני הג'לטין הנגרמים כתוצאה מהסרת מברשת הצבע כשהיא מתמצקת על ידי המסת שכבת פני השטח בעדינות על ידי הזזת נורת המנורה קרוב לפני השטח למשך מספר שניות.
7. מעבירים את צלחת הג'לטין למקרר ומשאירים בחום של 4 מעלות למשך 30-60 דקות.
8. במכסה אדים, חותכים גוש קטן (~ 1 x 1 ס"מ) המכיל את הרקמה המוטבעת בג'לטין של המנה בעזרת להב אזמל, מרימים את הבלוק בעזרת מרית קטנה ומניחים אותו בזהירות באותה תמיסת קיבוע אך טרייה המשמשת לקיבוע הפרוסות למשך 30 דקות לפחות ב-4 מעלות צלזיוס.
9. שטפו את גוש הג'לטין ב-5 מ"ל של 0.1 M PB שלוש פעמים, יבשו אותו בעזרת פיסת נייר והדביקו את צד הבלוק כלפי מעלה (כלומר, עם הטישו בחלקו העליון) על צ'אק ויברטום באמצעות דבק סופר.
10. הסר עודפי דבק בעזרת פיסת נייר פילטר והשתמש בלהב אזמל כדי לחתוך את פינות הבלוק ולהשאיר צורת יהלום.
11. חותכים את הפרוסה בעובי של 50 מיקרומטר בעזרת ויברטום ומניחים כל חלק בזהירות בבקבוקון זכוכית המכיל 10% סוכרוז.
12. הרם בזהירות חלק מהבקבוקון, והניח אותו שטוח במכסה צלחת פטרי. בעזרת מיקרוסקופ חיתוך ולהב אזמל טרי, הסר את הג'לטין מסביב לקטע והחזיר את החלק לבקבוקון המכיל 2 מ"ל סוכרוז טרי 10% סוכרוז
    הערה: חיוני להסיר כמה שיותר ג'לטין בשלב זה כדי להפחית את התכווצות הרקמות בשלב ההתייבשות (שלב 1.37).
13. הגן בהקפאה על החלקים בתמיסת סוכרוז-גליצרול מבוססת PB 0.1 M PB בטמפרטורת החדר על ידי דגירה למשך 10 דקות בתמיסת סוכרוז 10%, 20 דקות בתמיסת 20% סוכרוז-6% גליצרול פעמיים, ולבסוף 30 דקות בתמיסת 30% סוכרוז-12% גליצרול פעמיים בתסיסה מתמדת.
14. הניחו את החלקים שטוחים על מלבן קטן של נייר כסף בעזרת מברשת. הסר את עודפי הנוזלים מהחלקים וקפל בזהירות את נייר הכסף לחבילה.
15. החזק את החבילה קרוב לפני השטח של חנקן נוזלי מבלי לגעת במשטח למשך 30 שניות ולאחר מכן אפשר לחלקים להפשיר לחלוטין למשך כ-30 שניות. חזור על ההקפאה-הפשרה פעמיים נוספות.
16. הסר את כל החלקים בעזרת מברשת צבע והניח אותם בבקבוקון זכוכית המכיל 2 מ"ל של 0.1 M PB בתסיסה מתמדת כדי לשטוף עודפי סוכרוז.
17. הסר את ה-PB עם פיפטה פסטר ודגר את החלקים ב-2 מ"ל של מי חמצן מימי 1% (H₂O₂) למשך 30 דקות. שטפו את החלקים ב-2 מ"ל של 0.1 M PB 3x 5 דקות.
18. הסר את 0.1 M PB עם פיפטה פסטר והוסף 1% נתרן בורוהידריד (NaBH₄) ב-0.1 M PB.
    הערה: אין לכסות את הבקבוקון, מכיוון שתמיסת NaBH₄ פולטת גז מימן.
19. הסר את הנתרן בורוהידריד בעזרת פיפטה פסטר ושטוף את החלקים היטב ב -2 מ"ל של 0.1 M PB 5x 5 דקות.
20. החלף את ה-0.1 M PB ב-10% סרום עיזים רגיל (NGS) ב-0.1 M PB למשך 30 דקות.
21. הסר את נסיוב העיזים ודגר את החלקים למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בתערובת של נוגדנים חד-שבטיים של עכבר ונוגדנים רב-שבטיים של ארנב המורכבים מתמיסת ABC.
    הערה: רשימה של נוגדנים ראשוניים ששימשו במחקרים קודמים מוצגת בטבלה 1.
22. דגרו את החלקים למשך שעתיים בחושך בתערובת של נוגדנים משניים המסומנים פלואורסצנטית (טבלת חומרים).
23. הרכיב את החלקים על המגלשות במדיום הרכבה וכסה אותם בכיסוי.
24. צלמו תמונות של תיוג פלואורסצנטי בהגדלה של פי 40 (איור 1Bb).
25. לאחר הדמיית הקרינה, הנח את השקופית בצלחת פטרי מזכוכית המכילה PBS והסר בזהירות את הכיסוי. לאחר מכן שטפו את החלקים מהמגלשה באמצעות פולסים עדינים של PBS מפיפטה של פסטר. הנח את החלקים בבקבוקון זכוכית נקי המכיל PBS.
26. בצע את תגובת avidin-HRP על ידי דגירה ראשונה של החלקים ב-ABC למשך שעתיים לפחות כדי להגביר את תוצר תגובת ה-HRP.
27. הכן את תמיסת 3,5 diaminobenzidine (DAB) על ידי הוספת טבליה אחת ל-5 מ"ל מים מזוקקים.
28. שטפו את החלקים עם PBS שלוש פעמים למשך 10 דקות ולאחר מכן עם מאגר Tris פעמיים למשך 10 דקות. הסר את מאגר Tris לאחר הכביסה האחרונה.
29. הוסף במהירות טיפה אחת של תמיסת 8% NiCl₂ (ניקל כלוריד) לתמיסת ה-DAB, פיפטה פנימה והחוצה לערבוב, והוסף במהירות 1 מ"ל של תמיסה זו על החלקים. דגרו את החלקים בתמיסת DAB/NiCl₂ למשך 15 דקות.
30. הוסף 10 מיקרוליטר של 1% H₂O₂ לתמיסת ה-DAB. אפשר לתגובה להמשיך בחושך תחת תסיסה מתמדת למשך כ-1 עד 2 דקות, ופקח על תיוג התאים המלאים במיקרוסקופ מנתח.
31. עצור את התגובה על ידי הסרת תמיסת DAB/NiCl₂/H₂O₂ ושטוף את החלקים עם מאגר Tris פעמיים למשך 5 דקות.
32. במכסה אדים, הניחו עיגול קטן של נייר פילטר לתוך צלחת פטרי והרטיבו אותו עם 0.1 M PB. הרם את החלקים בזה אחר זה מבקבוקון הזכוכית בעזרת מברשת, והניח אותם בזהירות שטוחים על הנייר.
33. כסו את החלקים בעיגול לח נוסף של נייר סינון והסירו את המאגר העודף על ידי נגיעה עדינה בנייר טישו על פני השטח.
34. מרחו 8-9 טיפות של 1% אוסמיום טטרוקסיד ב-0.1 M PB על הנייר העליון, כסו את הכלי ושמרו במכסה האדים למשך 30 דקות לפחות, אך לא יותר משעה.
35. פתח את צלחת הפטרי והרם את נייר הסינון העליון. הרם את החלקים בזהירות בזה אחר זה בעזרת מברשת, הניח אותם בבקבוקון זכוכית ושטוף אותם במים מזוקקים פעמיים.
36. השלך פסולת אוסמיום טטרוקסיד כראוי. שטפו את כל הציוד החד פעמי והניחו אותם בפחים המתאימים.
37. הנח כל חלק שטוח על מגלשת זכוכית וכסה את החלקים. מעבירים את השקופית לצלחת פטרי, מניחים בקבוקון זכוכית ריק מעל הכיסוי כדי לשמור אותו במקומו, ומכסים ב-50% אלכוהול. לאחר 15 דקות, הסר את השקופית מהתמיסה והסר את החלקים מהשקופית. הנח את החלקים בחזרה על המגלשה ולאחר מכן הנח את המגלשה ב-70% אלכוהול למשך 15 דקות. חזור על אותו תהליך עם תמיסת אלכוהול של 95% ולבסוף 100%.
38. לאחר שלב ההתייבשות, העבירו את החלקים לבקבוקון זכוכית המכיל 100% אלכוהול על שייקר במכסה אדים. החלף את תמיסת האלכוהול בתחמוצת פרופילן (C₃H₆O) ושטוף שלוש פעמים למשך 5 דקות. לאחר הכביסה האחרונה, שמור ~2 מ"ל של תחמוצת פרופילן בבקבוקון והוסף שרף (יחס של 1:1). ודא שהשרף מומס ושמור על החלקים בתסיסה מתמדת למשך 30 דקות.
39. מניחים כל חלק בפלנצ'ט אלומיניום המכיל שרף אפוקסי בעזרת מקל עץ ודוגרים למשך הלילה.
    הערה: אל תשאיר את החלקים בשרף יותר מ-24 שעות כדי למנוע את הסיכון לפגיעה בחלקים.
40. מניחים את הפלנצ'ט על פלטה חמה למשך כ-10 דקות. מרימים כל חלק בעזרת מקל עץ ומניחים אותם על מגלשה נקייה. שמור על הכיוון של כל קטע עקבי באמצעות מיקרוסקופ מנתח. הנח כיסוי מעל החלקים. מכניסים את השקופית לתנור למשך 48 שעות בחום של 56 מעלות צלזיוס לריפוי.

טבלה 1: טבלת פתרונות.

פתרונות בשימוש	הרכב/הוראות
פתרון קיבוע	4% פרפורמלדהיד, 0.2% תמיסת חומצה פיקרית רוויה, 0.025% תמיסת גלוטראלדהיד במאגר פוספט 0.1 M (PB)
0.1 מ' חוצץ פוספט pH 7.6	הוסף 100 מ"ל של מלאי 1 M מאגר פוספט ל-900 מ"ל מים מזוקקים
תמיסת מלח חומצה פוספט (PBS) pH 7.4/7.5	הוסף 10 מ"ל של מאגר פוספט 0.1M, 0.2 גרם KCl ו-8.76 גרם NaCl ל-990 מ"ל מים מזוקקים
מאגר TRIS pH 7.5	ממיסים 5.72 גרם טריס הידרוכלוריד ו-1.66 גרם בסיס טריס ב-50 מ"ל מים מזוקקים. לאחר מכן הכינו עד 1 ליטר עם מים מזוקקים.
תמיסת קיבוע גלוטרלדהיד ופרפורמלדהיד חוצצת	4% פרפורמלדהיד, 0.2% תמיסת חומצה פיקרית רוויה, 0.025% תמיסת גלוטראלדהיד במאגר פוספט 0.1 M.
פתרון ABC	יש להכין את הפתרון לפחות 30 דקות לפני השימוש מערכת ABC. הוסף טיפה אחת של תמיסה A וטיפה אחת של תמיסה B ל-2.5 מ"ל של PBS.
שרף אפוקסי דורקופן:	להכנת 20 סירים: 20 גרם מרכיב A, 20 גרם מרכיב B, 0.6 גרם מרכיב C ו- 0.4 גרם מרכיב D-
	הגן על האיזון מפני שפיכה על ידי כיסוי הצלחת בעיגול נייר פילטר. שקלו בזהירות את הריאגנטים לכוס טריפור בפרופורציות שצוינו לעיל. מערבבים היטב על ידי ערבוב נמרץ בעזרת שני מקלות עץ למשך 5 דקות לפחות. התערובת צריכה להפוך לצבע חום כהה בצפיפות אחידה. הכניסו את הכוס לתנור בחום של ~50 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לכל היותר כדי להסיר כמה שיותר בועות אוויר. הערה: השרף יתחיל להתרפא אם תשאיר את הכוס בתנור יותר מ -10 דקות. הוציאו את השרף לסירי פלסטיק או למזרקים של 5 מ"ל, תאריכו אותם ואחסנו אותם במקפיא של -20 מעלות צלזיוס מוכן לשימוש.

תוצאות

איור 1: שחזורים עצביים של שני סוגים של תאי סל שהוקלטו ומולאו באזור CA2 בהיפוקמפוס ונתונים אלקטרופיזיולוגיים מתאמים שהתקבלו בעקבות הקלטות תוך-תאיות במבחנה. נתון זה שונה ממחקרים קודמים. SO Stratum Oriens, SP Stratum Pyramidale, SR Stratum Radiatum, SLM Stratum Lacunosum Moleculare. (A) Aa: שחזור של תא סל CA2 עם סוכת דנדריטי ואקסונלית מוגבלת באמצעות צינור ציור...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נוגדן אבידין-7-אמינו-4-מתילקומרין-3-חומצה אצטית (אבידין-AMCA) - 20.8 מ"ג/מ"ל	מעבדות וקטוריות	A2008
ביוציטין ≥98% (TLC)	סיגמא	B4261
3,5 דיאמינובנזידין (DAB) טבליות, להכנת 5 מ"ל	סיגמא	D4293
שרף אפוקסי דורקופן A	סיגמא	44611
שרף אפוקסי דורקופן B	סיגמא	44612
שרף אפוקסי דורקופן C	סיגמא	44613
שרף אפוקסי דורקופן D	סיגמא	44614
אתנול, פוריס. p.a., מוחלט, ≥99.8%	סיגמא	32221
ג'לטין	סיגמא	48723
תמיסת גלוטרלדהיד, דרגה I, 25% ב-H2O	סיגמא	G5882
גליצרול, ≥99%	סיגמא	G5516
סרום עיזים	סיגמא	G9023
עיזים נגד עכברים פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) - 14.3 מ"ג/מ"ל	סיגמא	F2653
עיזים נגד ארנב טקסס אדום (TR)- 3.3 מ"ג/מ"ל	Invitrogen	T2767
מי חמצן, תמיסה 30%	סיגמא	H-1009
שמן טבילה, צמיגות 1.250 cSt (lit.)	סיגמא	I0890
ניקל כלוריד	סיגמא	N5756
אוסמיום טטרוקסיד, למיקרוסקופ אלקטרונים, 4% במים	סיגמא	75632
פרפורמלדהיד, דרגת ריאגנט, גבישי	סיגמא	P6148
חומצה פיקרית, לחה במים, ≥98%	סיגמא	197378
מאגר פוספט 1 M	סיגמא	P3619
תחמוצת פרופילן, 99%	אלפא אזר	30765
נתרן טטרה-הידרובוראט	VWR	27885.134
סוכרוז	פישר מדעי	S/8600/53
טריזמה הידרוכלוריד, ≥99.0%	סיגמא	T5941
בסיס טריזמה, ≥99.9%	סיגמא	T6066
Vectashield Antifade Mounting Medium, , מקדם שבירה 1.45	מעבדות וקטוריות	H-1000
ערכת Vectastain Elite ABC HRP	מעבדות וקטוריות	PK6100
ציוד בשימוש
ויברטום	אגר סיינטיפיק
C4A פלנצ'טות אלומיניום מכוסות	GA-MA & ASSOCIATES, INC.
מיקרוסקופ Leica DMR	לייקה מיקרוסיסטמס
X-Cite 120PC Q מקור אור פלואורסצנטי	Excelitas Technologies
מצלמת מיקרוסקופ דיגיטלית Leica DFC450	לייקה מיקרוסיסטמס
עט שרטוט טכני רפידוגרף 0.18 מ"מ	המרכז הגרפי של לונדון
0.18 מ"מ רפידוגרף nib	המרכז הגרפי של לונדון
עט ציור טכני רפידוגרף 0.25 מ"מ	המרכז הגרפי של לונדון
0.25 מ"מ רפידוגרף nib	המרכז הגרפי של לונדון
מערכת Neurolucida כולל תחנת עבודה למחשב, במה, מצלמה וג'ויסטיק לבקרת שלב XYZ	מיקרובריגפילד (MBF) מדעי הביולוגיה
Neurolucida software version 2017	מיקרובריגפילד (MBF) מדעי הביולוגיה
CorelDRAW graphics Suite X5	קורל
תוכנה לעריכת וידאו	Adobe Premiere Pro
בקבוקוני זכוכית 14 מ"ל	פישר מדעי