מאמר שיטה

הערכת ליקוי מוטורי במודלים של C. elegans באמצעות בדיקת תנועה רדיאלית

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Currey, H. N., et al. הערכת ליקוי מוטורי במודלים של C. elegans מודלים של טרשת אמיוטרופית צידית. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מדגים את השימוש בבדיקת תנועה רדיאלית כדי להעריך תפקוד לקוי של מוטוריקה ב-C. elegans המבטא חלבון TDP-43 אנושי מסוג פרא או מוטנטי ALS. תולעים עם רמות שונות של ביטוי TDP-43 מסוג בר או מוטנטי מורשות לזחול, ותנועתן נמדדת על ידי המרחק הרדיאלי שעובר מהנקודה המרכזית על לוחית הבדיקה. הבדיקה מבחינה בין ליקויים מוטוריים קלים, בינוניים וחמורים על סמך המרחק שעברו הזנים השונים C. elegans.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בדיקת תנועה רדיאלית

  1. הכינו צלחות פטרי בקוטר 100 מ"מ או 150 מ"מ כמחצית מלאות במצע גידול נמטודות (NGM) וזרעים עם מדשאה אחידה של חיידקי OP50 כדי לכסות את כל שטח האגר.
  2. הפוך את לוחות הבדיקה של NGM הפוך וסמן את החלק התחתון עם מזהה עבור C. elegans זנים לבדיקה, 2 צלחות לכל זן ( איור 1A).
  3. צרו נקודה קטנה עם הסמן במרכז הלוח ההפוך (איור 1A).
  4. תוך כדי עבודה עם מיקרוסקופ מנתח, העבירו 15-20 תולעים תואמות מבוימות למרכז לוחית הבדיקה ישירות מעל הנקודה המרכזית (נראית דרך ה-NGM) באמצעות פיק חוט פלטינה (איור 1B).
    הערה: נסה להעביר את כל התולעים בו זמנית או מהר ככל האפשר.
    1. הגדר טיימר למשך 30 דקות לאחר הנחת תולעים במרכז הצלחת. החזירו את המכסה לצלחת והניחו אותו בצד ( איור 1C).
  5. המשך להעביר תולעים עד שכל הזנים נמצאים על לוחות הבדיקה המיועדים, ורשום בערך כמה זמן לוקח לעבור בין הצלחות (כוון ל~ דקה אחת בין הצלחות). שמור את כל הצלחות באותו סדר שבו הן הוקמו.
  6. לאחר 30 דקות, התחל להבקיע את הצלחת הראשונה.
    1. הסר את המכסה והנח את הצלחת עם הפנים כלפי מטה מתחת למיקרוסקופ הניתוח, כך שהחלק האחורי המסומן של הצלחת פונה כלפי מעלה, ואגר ה-NGM נמצא בין קו הראייה לתולעים. הצלחת תהיה הפוכה משימוש רגיל.
    2. כוונן את מיקוד המיקרוסקופ עד שתולעים נראות דרך האגר.
    3. בעזרת עט קצה לבד בצבע שונה מנקודת המרכז, שים נקודה קטנה במיקום של כל תולעת - עקוב אחר עקבות התולעים דרך מדשאת החיידקים כדי למצוא את החיות המרוחקות ביותר.
    4. בדוק את קצה הצלחת מכיוון שחלק מהתולעים עלולות להגיע לשם. כמו כן, ספרו ורשמו את מספר התולעים בנקודת המרכז ( איור 1D).
  7. המשך לסמן את כל לוחיות הבדיקה לפי הסדר, כך שלכל הלוחות יש זמן פעילות של 30 דקות, והקפידו לקחת בחשבון את הזמן שלקח להקים את הצלחת. לאחר מכן, בצע מדידות ידניות או דיגיטליות כמתואר בשלבים 1.8 או 1.9.
  8. בצע מדידות ידניות באמצעות סרגל.
    1. השתמש בסרגל כדי למדוד במ"מ, את המרחק מנקודת המרכז לסימוני המיקום הסופיים עבור כל תולעת ולרשום את המרחק. כדי לעזור לעקוב אחר ההתקדמות במהלך הניקוד, סמן את הנקודה הראשונה שהושגה בקו סימון קטן.
    2. רשום נתוני אורך עבור כל נקודה ברצף על ידי סיבוב הלוח בכיוון השעון (איור 1E).
  9. בצע מדידה דיגיטלית באמצעות סורק ו-ImageJ.
    1. באמצעות סורק שטוח, סרקו את החלק האחורי של לוחות הבדיקה ליד סרגל (מספרים הפונים למשטח הסריקה) (איור 2A).
    2. פתח את תמונת הלוח הסרוק ב-ImageJ או בתוכנית דומה.
      הערה: ImageJ היא תוכנה חינמית לעיבוד תמונה מבוססת ג'אווה המתארחת על ידי ה-NIH.
    3. לחצו על הכלי קו ישר ואז ציירו קו המחבר את הנקודות של 1 ס"מ ו-2 ס"מ בתמונה הסרוקה של הסרגל (איור 2B).
      הערה: לחיצה ממושכת על מקש המחשב Shift תאלץ את הקו לזווית הקרובה ביותר של 45°.
    4. נווט אל תפריט נתח והשתמש בו כדי להגדיר את קנה המידה ( נתח | הגדר קנה מידה) ( איור 2C).
    5. הזן את מרחק ידוע (10) ו-יחידות אורך (מ"מ) בתיבות המתאימות, אל תתאים את המרחק במספר פיקסלים. סמן את Global כדי להחיל את אותו קנה מידה על כל התמונות המנותחות בכל סשן של ImageJ; אחרת, הגדר את קנה המידה עבור כל תמונה עם הפתיחה (איור 2D). לחץ על Ok.
      הערה: שלבים 1.9.2-1.9.5 מבוצעים כדי לקבוע את סולם המדידה. מדידות עבור תמונה זו יקשרו כעת באופן אוטומטי את אורך הקווים ליחס המוגדר בין פיקסל לאורך. לתמונות שנסרקות ברזולוציה של 300 dpi יהיה קשר משוער של 11.8 פיקסלים למ"מ.
    6. השתמש בכלי מברשת הצבע כדי לסמן ממש מעל הנקודה הראשונה שיש להבקיע.
      הערה: זהו אינדיקטור חזותי לתולעת הראשונה שהובקעה.
    7. השתמש בכלי קו ישר כדי לצייר קו מנקודת המרכז לנקודת הנתונים הראשונה של התולעת.
    8. לחץ על מקש M במקלדת כדי למדוד את המרחק. לחלופין, נווט לתפריט נתח ובחר מדוד ( נתח | למדוד). בשני המקרים, המדידה תופיע בחלון חדש; חלון זה יאסוף את כל המדידות לכל תמונה.
    9. שמור על נקודת המרכז קבועה, הזז את קצה הקו הנוגע בנקודת התולעת הראשונה לנקודת התולעת הבאה, זז עם כיוון השעון ולחץ על מקש M כדי למדוד.
    10. המשך למדוד כל נקודה בכיוון השעון עד שכל הנקודות יקבלו ניקוד.
    11. העתק את ו- הדבק את נתוני מדידת האורך בגיליון אלקטרוני כדי לשמור אותם. לאחר מכן, חזור על התהליך עבור כל תמונת צלחת סרוקה.
      הערה: שלבים 1.9.6 - 1.9.11 מודדים את ערכי תזוזה של התולעת (איור 2E-F).
  10. לבצע ניתוח סטטיסטי.
    1. שלב שכפולים בניסוי יחיד כך שהמספר הכולל שקיבל ניקוד הוא בין 30-40 תולעים.
    2. בצע שכפולים ניסיוניים עצמאיים בימים שונים ועם אוכלוסיות עצמאיות של תולעים כדי להגיע ל-3 שכפולים ניסיוניים עצמאיים.
    3. נתח נתונים באמצעות ניתוחים סטטיסטיים מתאימים כגון מבחן t של סטודנט עבור 2 זנים או ANOVA חד כיווני עבור שלושה זנים או יותר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
איור 1: זרימת עבודה של בדיקת תנועה רדיאלית. חלוניות A-E מציגות את השלבים המוכללים של בדיקת התנועה הרדיאלית. השלבים הם כדלקמן: (A) לוחות NGM, עם OP50 זרוע בקצוות, מוכנות על ידי תיוג וסימון נקודה מרכזית, (B) תולעים ממוקמות במרכז האגר כפי שמסומן על ידי הנקודה המרכזית, (C) תולעים מורשות לנוע בחופשיות למשך פרק זמן מוגדר, (D

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
C. elegansהמרכז לגנטיקה של Caenorhabditis (CGC)-קבל את הזנים שלך כרצונך, N2 הוא זן בקרה שימושי
פיפטות פסטר חד פעמיות, זכוכית בורוסיליקטVWR14673-010פיפט זכוכית המשמש ליצירת פיק תולעים - החזק פיפטת זכוכית ביד אחת ו~1 אינץ' של חוט פלטינה (מוחזק על ידי צבת) ביד השנייה מעל להבה כדי להצטרף.
צלחות פטרי חד פעמיות, 35x10 מ"מVWR10799-192לוחות בדיקה עבור מערכת ההדמיה של WormLab
צלחות פטרי חד פעמיות, 60x15 מ"מVWR25384-090לוחות מלאי לתולעים
צלחות פטרי חד פעמיות, 100x15 מ"מVWR25384-302לוחית בדיקת תנועה רדיאלית סטנדרטית
צלחות פטרי חד פעמיות, 150x15 מ"מVWR25384-326לוח בדיקת תנועה רדיאלית במסגרת זמן ארוכה יותר
ניתוח מיקרוסקופלייקהM80היקף לתחזוקת תולעים והגדרת מבחני תנועה רדיאליים
סמנים עדיניםVWR52877-810צריך לפחות 2 צבעים לבדיקות תנועה רדיאליות. טיפים עדינים נדרשים לדיוק.
סורק שטוחאמזוןEpson Perfection V850אופציונלי לבדיקת תנועה רדיאלית. הפרוטוקול מניח רזולוציה של 300dpi, רוב הסורקים יעבדו מצוין
NGM (מדיום גידול נמטודות)VWR76347-412מדיום המשמש לגידול C. elegans. ניתן להכין מאפס, ראה WormBook: Maintenance of C. elegans
חיידקי OP50המרכז לגנטיקה של Caenorhabditis (CGC)OP50מקור מזון עיקרי ל-C. elegans
p1000 pipettorVWR76207-552Pipettor, משמש בבדיקת שחייה
p1000 טיפיםVWR83007-384טיפים לפיפטטור, המשמש במבחן שחייה
חוט פלטינה, קוטר 0.2032 מ"מVWRBT136585-5Mחוט פלטינה עדין המשמש ליצירת פיק תולעת - החזק פיפטת זכוכית ביד אחת ו~1 אינץ' של חוט פלטינה (מוחזק על ידי צבת) ביד השנייה מעל להבה כדי להצטרף.
סרגלVWR56510-001צריך לנקד מבחני תנועה רדיאליים
תמונהJNIH-תוכנה חופשית אופציונלית מסופקת על ידי
ה-NIH - https://imagej.nih.gov/ij/
מערכת הדמיה של WormLabMBF Bioscienceמעבדת תולעיםמערכת ההדמיה כוללת
חומרת WormLab (שדה בהיר
במה, מצלמה ודיור)
ותוכנת WormLab. https://
www.mbfbioscience.com/wormlabimaging-
מערכת

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

C elegansTDP 43ALS

מאמרים קשורים