כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבחינת אתיקה של בעלי חיים.
1. הכנה
- הכנת רקמות וחתך
- חלקו חולדות באופן אקראי לשלוש קבוצות: טרי/מלוח (SAL; 0.9% NaCl), קידומת/SAL וקידומת/3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ראו פרטים בטבלה 1).
- יש לתת שלוש מנות של 1 מ"ל/ק"ג SAL ו-10 מ"ג/ק"ג MDMA תוך צפקית, בהתאמה, לקבוצות SAL ו-MDMA במרווח של שעתיים. אפשר לבעלי חיים לשרוד את הטיפול במשך 6 ימים.
- ביום השביעי, יש לתת 100 מ"ג/ק"ג קטמין בשילוב של 5 מ"ג/ק"ג קסילזין תוך צפקי לחולדות להרדמה עמוקה (כלומר, אובדן מצמוץ בקרנית ורפלקסים של צביטה בזנב).
- עבור קבוצת הטרי/SAL, ערפו במהירות את ראשי החולדות והוציאו את המוח לבדיקת המוח הטרי.
- עבור קבוצות הקידומת/SAL והקידומת/MDMA, בצע חתך לאורך עצם החזה כ-10-12 ס"מ ולאחר מכן חשוף את קצה עצם החזה.
- החזיקו את קצה עצם החזה עם המוסטט וחתכו את הסרעפת לרוחב משני הצדדים בעזרת מספריים חדים ואז חתכו כלפי מעלה על פני הצלעות ובמקביל לריאות.
- ביד אחת, החזק את קצה הגחון של הלב בעזרת מלקחיים קטנים. ביד השנייה, חודרים את החדר השמאלי עם מחט מזרק 18 G (שימו לב שצד המתאם של המחט מחובר עם צינור סיליקון בצורת Y למיכלי SAL ופרפורמלדהיד קרים כקרח ומשאבות פריסטלטיות).
- הפעל את משאבת ה-SAL ברמה הבינונית של קצב הזרימה (~5 מ"ל/דקה) ונקב את הפרוזדור הימני עם המלקחיים כדי לאפשר בריחה של זרימת הדם החוזרת. שמור על זלוף SAL למשך 30 דקות.
- הפעל את משאבת הפרפורמלדהיד ברמה הבינונית ואפשר לפרפורמלדהיד 4% קר כקרח לחלחל את החיה למשך 30 דקות.
- הסר את מכשיר הזלוף וערוף את ראשו של בעל החיים. בצע חתך אחורי אחורי דרך קו האמצע של הגולגולת, ולאחר מכן דש את הגולגולת כדי לחשוף את חלל הגולגולת.
- הסר את המוח בעזרת מרית מחלל הגולגולת והנח את המוח בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל המכיל 25 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד. שמור את המוח בתוך הצינור המכיל פרפורמלדהיד במקרר של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
- העבירו את המוח לתוך שפופרת צנטריפוגה של 50 מ"ל המכילה 25 מ"ל של תמיסת סוכרוז 30% בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים. לבסוף, אחסן את המוח בתוך שקיות ניילון בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- הרכיבו את המוח על צ'אק עם מדיה מוטמעת והקפיאו את המדיה המוטמעת המכילה מוח בקריוסטט בטמפרטורה של -26 מעלות צלזיוס. חתכו את המוח הקפוא הטרי למקטעים של 20 מיקרומטר ואת המוח עם הקידומת פרפורמלדהיד למקטעים של 10 מיקרומטר. העבר את הקטע לשקופית מיקרוסקופ בטמפרטורת החדר (RT) על ידי נגיעה בשקופית בקטע.
- יבש באוויר ב-RT למשך 4 שעות. אחסן את שקופיות החלק בשקית אטומה הדוקה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- התייבשות
- קח שקופיות מהמקפיא של -80 מעלות צלזיוס והקצה חלקים לאחת משלוש בדיקות: גן קולטן סרוטונין 5-HT2A (ht2a), ppiB (גן פפטידילפרוליל איזומראז B, בקרה חיובית) או dapB (גן חיידקי דיהידרודידיפיקולינט רדוקטאז, בקרה שלילית); סמן ותייג קטעים בעט כדורי (אין להשתמש בעיפרון). טבלו מגלשות ב-100% אלכוהול ב-RT למשך 5 דקות. יבש את השקופיות למשך 5 דקות במכסה אדים.
- טיפול מקדים
- פיפטה 20 מיקרוליטר של המגיב Pretreatment-1 (השבתת פוספטאז אלקליין) לחלקים בשקופיות. הניחו את השקופיות על מסילת מתלה במגש לחות (שימו לב שהמגש מכוסה במכסה לשמירה על לחות גבוהה למניעת אידוי מתמיסת התגובה).
- מנערים בעדינות את מגש הלחות על שייקר אופקי במהירות נמוכה למשך 10 דקות. שוטפים את השקופיות פעמיים במים מזוקקים פעמיים (ddH2O) למשך 2 דקות. טובלים את השקופית בכוס של 200 מ"ל המכילה 150 מ"ל של מגיב Pretreatment-2 (שבירת הקשרים הצולבים הנגרמת על ידי קיבוע פרפורמלדהיד). מרתיחים את השקופיות בסך הכל 5 דקות בחום של 100 מעלות צלזיוס (שיקום המושרה בחום של מבנה ה-RNA).
- שטפו את השקופיות פעמיים עם ddH2O למשך 2 דקות. הניחו את השקופיות ב-100% אלכוהול למשך 5 דקות. יבשו את השקופיות למשך 5 דקות במכסה האדים. השתמש בעט הידרופובי כדי לצייר עיגול סביב האזור שנבחר בקטע הרקמה (למשל, מבנים שאינם קליפת המוח, כולל תלמוס והיפותלמוס כפי שמתואר באיור 1).
- פיפטה 10 מיקרוליטר של המגיב Pretreatment-3 (מגביר את חדירת הבדיקה) לכל אזור שנבחר וכסה את מגש הלחות במכסה. הכניסו את המגש לתנור ההיברידיזציה המצויד בשייקר האופקי והגדירו את טמפרטורת התנור על 40 מעלות צלזיוס; מנערים בעדינות את המגש למשך 30 דקות. שטפו את השקופיות פעמיים עם ddH2O למשך 2 דקות.
2. הכלאה והגברה
- פיפטה 10 מיקרוליטר של ריאגנטים לבדיקה htr2a, ppiB ו-dapB, בהתאמה, באזורים שנבחרו. מכסים את מגש הלחות במכסה כדי למנוע אידוי של המגיב. נער בעדינות את השייקר האופקי המוגדר במהירות נמוכה. דוגרים את השקופיות בחום של 40 מעלות צלזיוס בתנור למשך שעתיים.
- שוטפים את השקופיות פעמיים עם מאגר כביסה למשך 2 דקות. פיפטה 10 מיקרוליטר של המגיב Amplification-1 על כל אזור שנבחר, מנערים ומדגרים את השקופיות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- שוטפים את השקופיות פעמיים עם מאגר כביסה למשך 2 דקות. פיפטה 10 מיקרוליטר של המגיב Amplification-2 על כל אזור שנבחר, מנערים ומדגרים את השקופיות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
- שטפו את השקופיות פעמיים עם מאגר כביסה למשך 2 דקות. פיפטה 10 מיקרוליטר של המגיב Amplification-3 על כל אזור שנבחר, נערו ודגרו את השקופיות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- שוטפים את השקופיות פעמיים עם מאגר כביסה למשך 2 דקות. פיפטה 10 מיקרוליטר של המגיב Amplification-4 על כל אזור שנבחר, מנערים ומדגרים את השקופיות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
- שטפו את השקופיות פעמיים עם מאגר כביסה למשך 2 דקות. פיפטה 10 מיקרוליטר של המגיב Amplification-5 על כל אזור שנבחר, נערו ודגרו את השקופיות ב-RT למשך 30 דקות.
- שוטפים את השקופיות פעמיים עם מאגר כביסה למשך 2 דקות. פיפטה 10 מיקרוליטר של המגיב Amplification-6 על כל אזור שנבחר, מנערים ומדגרים את השקופיות ב-RT למשך 15 דקות. שוטפים את השקופיות פעמיים עם מאגר כביסה למשך 2 דקות.
3. זיהוי אותות
- פיפטה 10 מיקרוליטר של המגיב האדום לכל אזור שנבחר (שימו לב שהמגיב הוא תערובת של Red-B ו-Red-A ביחס של 1:60 ויש להשתמש בו מיד). הנח את השקופית במגש הלחות על השייקר האופקי ב-RT ונער בעדינות במהירות נמוכה למשך 10 דקות.
- שוטפים את השקופיות פעמיים עם (ddH2O) למשך 10 דקות. מייבשים את השקופיות בחום של 60 מעלות צלזיוס בתנור למשך 15 דקות. מניחים את השקופיות בקסילן מתחת למכסה האדים למשך 5 דקות. פיפטה 20 מיקרוליטר של מדיית הרכבה על בסיס קסילן על כל אזור שנבחר ומכסים בכיסוי.