אינדוקציה של דיכאון ארוך טווח בנוירונים של פורקינג'ה במוח הקטן בפרוסת מוח של עכבר

תקציר

מקור: Yamaguchi, K., et al. הערכה של השראת דיכאון לטווח ארוך בפרוסות מוח בוגרות. J. Vis. Exp. (2019)

בסרטון זה, נעשה שימוש בפרוסת מוח מוח של עכבר כדי לחקור אינטראקציות סינפטיות בין סיבים מקבילים, סיבים מטפסים ותאי פורקינג'ה, החיוניים לשליטה מוטורית. גירוי של סיבים מטפסים גרם לדיכאון ארוך טווח (LTD) בתאי פורקינג'ה, החליש את החוזק הסינפטי וכתוצאה מכך תגובה מופחתת לגירוי סיבים מקבילים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. חיתוך מוח

1. כוון את הדגימה כך שהצד הגבי של המוח הקטן יהיה בצד הקדמי. יוצקים חיתוך קר כקרח ACSF (נוזל מוחי מלאכותי), המכיל 1 מיקרומטר TTX (טטרודוטוקסין), מספיק כדי לטבול את המוח הקטן לחלוטין. הכניסו צינור גז לתוך ה-ACSF והתחילו לבעבע עם תערובת הגזים O₂/CO₂.
2. הסר את החומר הארכנואיד באמצעות פינצטה עדינה מתחת למשקפת. חותכים את הפדונקל המוחי בעזרת להב, ומסירים את גזע המוח וגוש האגר. סובב את המגש ב-180 מעלות, כך שהמשטח הגבי של המוח הקטן פונה לסכין גילוח.
3. הגדר את הלהב והתאם את מיקום החיתוך הראשון. הגדר את פרמטרי חיתוך הוויברטום לדברים הבאים: משרעת ל-5.5, תדר ל-85 הרץ, מהירות ל-3-4 ועובי פרוסה ל-300 מיקרומטר.
4. העבירו את פרוסת המוח הקטן על רשת ניילון לאינקובטור אקרילי וטבלו את הפרוסה לחלוטין ב-ACSF המחומצן. יש למקם את האינקובטור באמבט מים ששומר על טמפרטורה של 26 מעלות צלזיוס.
5. אחסן את הפרוסות לפחות שעה אחת כדי לאפשר התאוששות מהנזק במהלך החיתוך.

2. הקלטת מהדק תיקון של תא שלם

הערה: הקלטת מהדק תיקון דורשת את הציוד הבא: מיקרוסקופ זקוף עם אופטיקה של ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות אינפרא אדום (IR-DIC), מגבר מהדק תיקון, דיגיטייזר נתונים, ממריץ דיגיטלי, מבודד, מחשב, תוכנה לאיסוף וניתוח נתונים, מניפולטור ממונע, פלטפורמת מיקרוסקופ, שולחן בידוד רעידות, כלוב פאראדיי, מערכת חימום תמיסה, משאבות פריסטלטיות ומושך אלקטרודות.

1. הוסף פיקרוטוקסין (0.1 מ"מ) ל-ACSF ופתור אותו באמצעות אולטרה-סוניקציה למשך 3 דקות.
2. החדרת תא הקלטה עם ACSF רווי O2-CO2 המכיל פיקרוטוקסין בקצב של 2 מ"ל לדקה. שמור על טמפרטורת תא ההקלטה בסביבות 30 מעלות צלזיוס.
3. צור אלקטרודת הקלטה על ידי משיכת נימי זכוכית בורוסיליקט עם נימה (קוטר חיצוני = 1.5 מ"מ) באמצעות מושך עם 4 שלבים. קוטר הקצה צריך להיות בסביבות 1 מיקרומטר.
4. צור אלקטרודה מגרה על ידי משיכת אותו נימי באמצעות המושך ב-2 שלבים, ואז שבור כדי לייצר קצה עדין על ידי פגיעה בקצה בגוש ברזל מתחת למיקרוסקופ דו-עיני. הקוטר הסופי צריך להיות 3-5 מיקרומטר.
5. העבירו את פרוסת המוח הקטן לתא ההקלטה וקבעו אותה עם משקולת Pt-עם חוטי ניילון. מלאו אלקטרודה מגרה ב-ACSF.
6. לגירוי של ה-PFs, הנח את האלקטרודה המגרה על פני השכבה המולקולרית, במרחק של כ-50 מיקרומטר משכבת התאים של פורקינג'ה.
7. לגירוי ה-CF, הנח את האלקטרודה המגרה בתחתית שכבת תאי פורקינג'ה (שלבים 3.3, 3.4).
8. סנן פתרון פנימי מבוסס K⁺ או מבוסס Cs⁺ עם מסנן של 0.45 מיקרומטר. השתמש במיקרו-מעמיס כדי למלא אלקטרודת הקלטה בתמיסה פנימית של 8 מיקרוליטר.
9. הפעל לחץ חיובי חלש על אלקטרודת ההקלטה לפני טבילתה ב-ACSF. ההתנגדות שלו צריכה להיות 2-4 MΩ ויש לתקן את פוטנציאל הצומת הנוזלי.
10. התקרב לגוף התא הבריא והבהיר של המחשב עם אלקטרודת ההקלטה. דחוף מעט את פני תא פורקינג'ה, הפסק להפעיל לחץ חיובי, לאחר מכן הפעל לחץ שלילי עד ליצירת חותם ג'יגה-אוהם. לאחר מכן קבע את תצורת התא השלם באמצעות לחץ שלילי.
11. החזק את פוטנציאל הממברנה ב-70 mV, והפעל דופק -2 mV (משך, 100 אלפיות השנייה) ב-0.1 הרץ כדי לנטר את התנגדות הכניסה, התנגדות הסדרה וקיבול הכניסה, ברציפות. אל תשתמש בפיצוי ההתנגדות הסדרתי. השלך נתונים כאשר ההתנגדות הסדרתית משתנה ביותר מ-15%.

3. אינדוקציה של LTD (דיכאון ארוך טווח)

1. לעורר את השכבה המולקולרית בעזרת דופק (משך, 0.1 אלפיות השנייה). זהה את הזרמים הפוסט-סינפטיים המעוררים PF (סיבים מקבילים) (EPSC) על ידי הפעלת גירוי דופק כפול (מרווח אינטרספייק (ISI) של 50 אלפיות השנייה). ה-PF-EPSC אמור להראות הקלה על דופק מזווג ועלייה הדרגתית במשרעת ביחס לעלייה בעוצמת הגירוי.
2. רשום את תגובת הבדיקה של ה-PF-EPSC על ידי הפעלת דופק בודד ב-0.1 הרץ. התאם את עוצמת הגירוי כך שמשרעת ה-EPSC המעוררת תהיה בסביבות 200 pA. הימנע מזיהום זרם דרך התעלה היונית התלויה במתח.
3. לעורר את ה-CF בתחתית שכבת תאי הפורקינג'ה, ולזהות את ה-EPSC שנוצר על ידי הפעלת ה-CF (על ידי הפעלת גירוי דופק כפול). ה-CF-EPSC צריך להראות דיכאון דופק מזווג ואופן הכל או כלום בהתאם לעלייה בעוצמת הגירוי. עבור אינדוקציה בע"מ, יש להשתמש בגירוי יחיד.
4. LTD-inducing protocol 1
   1. באמצעות אלקטרודה המכילה תמיסה פנימית מבוססת K⁺ בתנאי מהדק זרם, הפעל גירוי PF יחיד וגירוי CF יחיד בו-זמנית ב-1 הרץ למשך 5 דקות (300 פולסים) ( איור 1A).
5. LTD-inducing Protocol 2
   1. באמצעות תמיסה פנימית מבוססת K⁺ המכילה אלקטרודה בתנאי מהדק זרם, הפעילו גירוי PF כפול (ISI של 50 אלפיות השנייה) וגירוי CF יחיד מכיוון שגירוי ה-PF השני עולה בקנה אחד עם גירוי CF ב-1 הרץ למשך 5 דקות (איור 1B).
6. פרוטוקול אינדוקציה בע"מ 3
   1. באמצעות אלקטרודה המכילה תמיסה פנימית מבוססת Cs⁺ בתנאי מהדק מתח, הפעל גירוי PF כפול (ISI של 50 אלפיות השנייה) וצעד מתח דה-פולריזציה יחיד (-70 עד 0 mV, 50 אלפיות השנייה) על הסומה ב-1 הרץ למשך 3 דקות, כך שגירוי ה-PF השני שווה ערך לתחילת שלב המתח הדפולריזציה (איור 1C).
7. LTD-inducing protocol-4
   1. באמצעות אלקטרודה המכילה תמיסה פנימית מבוססת Cs⁺ בתנאי מהדק מתח, הפעל את גירוי ה-PF (5x ב-100 הרץ) וצעד מתח דה-פולריזציה יחיד (-70 עד 0 mV, 50 אלפיות השנייה) על הסומה ב-0.5 הרץ למשך 3 דקות, בו זמנית (איור 1D).

תוצאות

איור 1: איור סכמטי של פרוטוקולים להשראת LTD בסינפסה PF-PC. (A) פרוטוקול 1 Cj. 1 גירויים PF ו-1 CF מופעלים בו זמנית 300 פעמים ב-1 הרץ (5 דקות) בתנאי מהדק זרם. אלקטרודה לרישום תא שלם מכילה תמיסה פנימית מבוססת K⁺. (B) פרוטוקול 2 Cj. 2 גירויים PF ו-1 CF מופעלים בו זמנית 300 פעמים ב-1 הרץ (5 דקות) בתנאי מהדק זרם. האלקטרודה מכילה תמיסה פנימית מבוססת K⁺

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מגבר	התקנים מולקולריים-אקסון	Multiclamp 700B
נימי זכוכית בורוסיליקט	סאטר	BF150-110-10
דיגיטייזר	התקנים מולקולריים-אקסון	Digidata1322A
מושך אלקטרודות	סאטר	דגם P-97
איזופלורן	FUJIFILM Wako Pure Chemical	26675-46-7
מבודד	א.מ.פ.י.	ISOflex
כלי פריסה ליניארי	Dosaka EM	PRO7N
מיקרוסקופ	ניקון	Eclipse E600FN
משאבה פריסטלטית	גילסון	משאבת ערוץ יחיד MP1
פיקרוטוקסין	סיגמא-אולדריץ'	P1675
יצרנית מים טהורים	Merck-Millipore	MilliQ 7000
תוכנה לניסוי	בדיקה מולקולרית-אקסון	pClamp 10
תוכנה לסטטיסטיקה	KyensLab	KyPlot 5.0
ממריץ	WPI	DS8000
בקר טמפרטורה	וורנר	TC-324B
טטרודוטוקסין	טוקריס	1078