מודל מבחנה לחקר חציית פתוגן של מחסום הדם-מוח וזיהום בתאי מוח

תקציר

מקור: da Costa, A., et al. מודל ממשק דם-מוח אנושי לחקר חציית מחסומים על ידי פתוגנים או תרופות והאינטראקציות שלהם עם המוח. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים מודל מבחנה לחקר פתוגנים החוצים את מחסום הדם-מוח (BBB). תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים, המבטאים צמתים הדוקים, יוצרים שכבת אנדותל בחדר העליון, בעוד נוירונים, אסטרוציטים ומיקרוגליה מייצגים את פרנכימת המוח בחדר התחתון, המופרדת על ידי קרום נקבובי. זיהום בנגיף במודל BBB מחקה את הפתוגן העובר מהדם למוח. עם החדרת נגיף נוירוטרופי, הוא חוצה את ה-BBB באמצעות טרנסציטוזיס, מדביק תאים עצביים, משכפל ומשחרר צאצאים ויראליים, ומדגים פלישה עצבית מוצלחת.

פרוטוקול

1. בנייה ובקרת איכות של מחסום דם-מוח (מחסום דם-מוח - מיני-מוח) (איור 1)

1. הגדרת מכשיר להכנסת תרבית ממברנה פוליאסטר BBB-Minibrain (איור 1B)
   1. גדל את קו תאי האנדותל של המוח האנושי (תאי hCMEC/D3) על 12 מסנני הכנסת תרבית ממברנה פוליאסטר למשך 6 ימים על מדיום תאי אנדותל לפני השימוש בהם לניסוי.
   2. מצפים צלחת של 12 בארות בפולי-D-ליזין (1 מ"ל/באר, 10 מיקרוגרם/מ"ל, 4 שעות ב-RT) ולאחר מכן למינין (1 מ"ל/באר, 1 מיקרוגרם/מ"ל, לילה ב-RT).
   3. הסר את הלמינין והוסף 1 מ"ל של מדיום תאי אנדותל בתוספת 5% סרום בקר עוברי (FBS) (5% מדיום תאי אנדותל).
   4. דגירה למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ ו-95% לחות.
   5. נסה בעדינות את הנוירונים האנושיים הפוסט-מיטוטיים (hNeurons) והאסטרוציטים האנושיים (hAstrocytes) (NT2-N/A) וקו תאי המיקרוגליה האנושיים (CHME/Cl5) ונתק את כדורי התא עם מדיום תאי אנדותל שלם.
   6. ספור את התאים, ערבב 3.6 x 10⁵ NT2-N/A ו-0.4 x 10⁵ תאי CHME/Cl5/באר וזרע את צלחת 12 הבארות.
   7. ב-T=24 שעות (24 שעות לאחר הזריעה): החלף את המדיום המשומש במדיום תאי אנדותל שלם טרי (תאי Minibrain ותאי אנדותל) והעבר את מסנן הכנסת תרבית הממברנה hCMEC/D3 פוליאסטר בחלק העליון של תאי ה-Minibrain. דגור על ה-BBB-Minibrain ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ ו-95% לחות.
      הערה: ה-BBB-Minibrain יהיה מורכב אז משכבה של תאי אנדותל אנושיים hCMEC/D3 על מסנן שמבודד את התא הלומינלי (או תא ה"דם") ומתרבית מעורבת של תאים אנושיים hNT2-N/A ו-hCHME/Cl5 (Minibrain) בתחתית הבאר המגדירה את תא האלומיניום (או תא ה"מוח") (איור 1B).
2. אימות חדירות האנדותל של BBB-Minibrain (בקרת איכות) (איור 1C)
   1. הכן את מאגר ההובלה (TB), שהוא מאגר HBSS (תמיסת המלח המאוזנת של הנקס) עם Ca²⁺ ו-Mg²⁺ בתוספת 10 מ"מ 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזינאתיאנסולפונית חומצה (HEPES) ו-1 מ"מ נתרן פירובט.
   2. הכן 12 צלחות באר עם 1.5 מ"ל של מאגר הובלה לבאר.
   3. ב-T=0, הכינו מאגר הובלה טרי בתוספת 50 מיקרומטר צהוב לוציפר (LY-TB).
   4. הפוך כל מסנן הפוך כדי להסיר בזהירות את המדיום מבלי להשפיע על מחסום תאי האנדותל.
   5. הנח את המסנן על צלחת 12 הבארות המלאה והוסף 0.5 מ"ל LY-TB.
   6. דגרו את הצלחות באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ ו-95% לחות.
   7. ב-T = 10 דקות העבירו את המסננים על 12 לוחות בארות מלאים ב-TB ושמרו על תא האלומיניום של הצלחת הראשונה לקריאת OD.
   8. ב- T= 25 דקות, חזור על שלב 1.2.7.
   9. ב- T = 45 דקות, עצור את ההובלה על ידי הסרת המסננים מהצלחות. שמור על תאים לומינליים ולומינליים לאמצעי OD.
   10. מעבירים ב-96 בארות חשוכות את הדגימות: 10 מיקרוליטר עם 190 מיקרוליטר TB עבור ה-LY-TB ותאי הלומינל, 200 מיקרוליטר של דגימה לתאי האלומיניום.
   11. מדוד את הקרינה של ה-LY-TB הקיימת בדגימות השונות ב-λ428 ננומטר λ535 ננומטר (גלים באורך עירור ופליטה בהתאמה).
   12. חשב את חדירות האנדותל (Pe) לכיוון LY-TB (Pe_LY) באמצעות הנוסחה:
       1/PSe= (1/PSt) – (1/PSf) ו-Pe_LY= PSe/S.
       הערה: PSf היא החדירות של המסנן ללא תאים, PST היא החדירות של המסנן עם תאים, PSe היא החדירות של זמן החד-שכבת האנדותל פני השטח של השכבה החד-שכבתית, S הוא פני השטח של השכבה החד-שכבתית (עבור מסנן 12 בארות = 1.12 ס"מ²), Pe_LY מתבטא בס"מ/דקה. עבור hCMEC/D3 ה-Pe_LY צריך להיות בין 0.7 ל-1.2 x 10^-3 ס"מ/דקה, תלוי בעיקר ב-FBS ששימש בניסויים. חשוב: Pe_LY גבוה מ-1.2 פירושו שה-BBB אינו הדוק מספיק וניתן להבחין בדליפה מסוימת. השליכו את המחסומים הללו.

2. שימוש ב-BBB-Minibrain כדי להדגיש את נוכחותם של חלקיקים נגיפיים נוירו-פולשניים בדגימת חיסון של וירוס קדחת צהובה, הווירוס הנוירוטרופי הצרפתי, YFV-FNV 34 (איור 2)

1. חציית BBB והכפלה של נגיפי קדחת צהובה במוח המיני
   1. השתמש ב-BBB-Minibrain שהוכן כמתואר בשלב 1.1.7 24 שעות לפני הוספת הנגיף; החלף את המדיום ב-2% מדיום תאי אנדותל FBS.
      הערה: חשוב ביותר להימנע משינוי המדיום רגע לפני הוספת הווירוס. שינוי המדיום יכול להפעיל את תאי האנדותל האנושיים ולפתוח באופן זמני את המחסום שיאפשר את מעבר הנגיף. כאן מחליפים את המדיום 24 שעות לפני תחילת הניסוי.
   2. ב-T=0, הוסף 3500 יחידות יוצרות פלאק (PFU) של YFV-FNV מדולל ב-50 מיקרוליטר של מדיום תאי אנדותל FBS 2% בזהירות רבה בחלק העליון של התא הלומינלי. הבקרה BBB-Minibrain מחוסן ב-50 מיקרוליטר של מדיום תאי אנדותל FBS 2% ללא וירוס. קבע את Pe_LY בבאר נלווית.
   3. דגרו את ה-BBB-Minibrain באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ ו-95% לחות.
   4. לאחר 24 שעות, הסר את מכשיר הסינון של תרבית ממברנת הפוליאסטר וקבע Pe_LY, דגימה של 1 מ"ל מהתא האלומינלי וטיטר את הנגיף. החלף את המדיום במדיום תאי אנדותל טרי של 2% FBS.
   5. דגור על ה-BBB-Minibrain ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ ו-95% לחות.
   6. לאחר 72 שעות, דגימת המדיום מתא הבלומינציה וטיטרציה של הנגיף, ו/או חילוץ ה-RNA מתאי ה-Minibrain לניתוח ביטוי גנים.

תוצאות

איור 1: מודל BBB-Minibrain. א. לוח זמנים של תרביות hCMEC/D3 וצילום של מכשיר BBB-Minibrain: תרבית ממברנה מפוליאסטר מוסיפה-מסנן עם מחסום אנדותל hCMEC/D3 מוחזק עם מלקחיים לפני הכנסתו לבאר אחת של צלחת תרבית תאים של 12 בארות. ב. קריקטורה המתארת את המכשיר עם תא הלומינל (דם) המכיל את מחסום תאי האנדותל ותא הבלומינל (המוח) המכיל את תאי המיני-מוח (נוירונים אנושיים, אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה). ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
12 לוחות באר	קורנינג	3336
צלחת פטרי 85 מ"מ	Sarstedt	83-3902-500
CHME/Cl5	Unité de Neuroimmunologie Virale	לבקשת ד"ר לאפון
CMC	קלביוכימיה	217274
צלחות באר כהות 96	קורנינג	3915
DMEM F12	תרמופישר סיינטיפיק	31330-038
DMSO	מרק-סיגמא אולדריץ'	D2650
אנדוגרו IV	Millipore	SCME004
אתנול	קרלו ארבה	529121
FBS	שיבוט	SV30015-04	מדיום תאי אנדותל
HBSS עם Ca2+-mg2+	תרמופישר סיינטיפיק	14025-100
hCMEC/D3	ארזלן	CLU512
Hepes 1M	תרמופישר סיינטיפיק	15630-070
למינינית	Merck-Sigma Aldrich	L6274
L-גלוטמין	תרמופישר סיינטיפיק	25030-024
לוציפר צהוב	מרק-סיגמא אולדריץ'	L0259
MEM 10X	תרמופישר סיינטיפיק	21430
MEM 1X	תרמופישר סיינטיפיק	42360
Ntera/Cl2D.1	ATCC	CRL-1973
פרפורמלדהיד	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	15714
PBS ללא Ca2+-Mg2+	תרמופישר סיינטיפיק	14190
PBS-CA2+-mg2+	תרמופישר סיינטיפיק	14040-091
עט/סטרפטוקוק	יורוביו	CXXPES00-07
פולי-די-ליזין	Merck-Sigma Aldrich	P1149
להאריך זהב	תרמופישר סיינטיפיק	P36930
ערכת טיהור רנ"א	קיאגן	74104
נתרן ביקרבונט 5.6%	יורוביו	CXXBIC00-07
נתרן פירובט	תרמופישר סיינטיפיק	11360
T75 Cell+ בקבוקון	סארסטדט	83-1813-302	בקבוק פוליסטירן לתרבית רקמות עם טיפול משטח ספציפי (Cell+) לתאים נדבקים רגישים
טרנסוול	קורנינג	3460	מוסיף תרבית ממברנה נקבובית פוליאסטר
טריפסין-EDTA	מרק-סיגמא אולדריץ'	T3924
מים טהורים במיוחד	תרמופישר סיינטיפיק	10977-035
Versene	תרמופישר סיינטיפיק	15040-033	EDTA
YFV-FNV	IP Dakar	בקבוקון חיסון