1. הכנת זבובים לניסויי FlpOut רב-צבעוניים (MCFO)
הערה: טכניקת MCFO מתייחסת לגרסה שונה של מה שנקרא כריתת קלטת עצירה בתיווך Flp (FlpOut). זבובי MCFO טרנסגניים נושאים רקומבינאז מקדם הלם חום (hsp)-Flp ומדווחים שונים תחת בקרת רצף הפעלה במעלה הזרם (UAS). כל מדווח מורכב מעמוד שדרה משותף של חלבון פלואורסצנטי ירוק (sfGFP), שבו הוכנסו 10 עותקים של תג אפיטופ (למשל, HA, FLAG או V5). החלבונים הלא-פלואורסצנטיים המתקבלים נקראים "מפלצת ספגטי GFPs" (smGFPs) וניתן לזהות אותם באמצעות נוגדנים ספציפיים כנגד תגי האפיטופים השונים.
- עף צולב עם קלטת MCFO ו-hsp-Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) לקווי הנהג GAL4 המתאימים (ראה טבלת חומרים).
- מכיוון שה-hsp כבר פעיל ב-25 מעלות צלזיוס ותאים מעטים עשויים לעבור רקומבינציה המובילה לתיוג לא ספציפי, הגדר צלבים ב-18 מעלות צלזיוס על מנת למנוע דליפה של המערכת. המתן כ-20 יום ב-18 מעלות צלזיוס כדי לקבל את דור F1. לאחר הלם החום (ראה שלב 2), שמרו על זבובים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס (איור 1).
2. הלם חום
הערה: בהתאם לאתר ההכנסה, היעילות של hsp-Flp עשויה להיות שונה; לכן, יש למטב את זמן הלם החום האופטימלי. עבור פרוטוקול זה, נעשה שימוש במלאי זבוב MCFO שבו הוכנס hsp-Flp לכרומוזום X (ראה טבלת חומרים).
- העבירו את צאצאי הצלב בשלב 1.1 (זבובים מדור F1, בני 3-4 ימים) לבקבוקונים חדשים המכילים מזון וחשמלו אותם בחום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
הערה: זבובים צעירים (בני 1-2 ימים) רגישים מאוד להלם חום. יש להמתין יום או יומיים נוספים לפני ביצוע מכת החום על מנת להפחית את שיעור התמותה הנגרם מהטיפול. השתמש בחלק מזבובי דור F1 כבקרה, ללא הלם חום.
- במהלך הלם החום, שמור זבובים בבקבוקונים רגילים עם מזון על מנת להפחית את שיעור התמותה הנגרמת על ידי עקה. שים נקבות וזכרים בבקבוקונים נפרדים.
- הקפידו לטבול את כל הבקבוקון במים כדי להבטיח הלם חום הומוגני. השתמש בזעזוע של 5-8 דקות כנקודת התחלה מתאימה לתיוג דליל של תאי גליה עם קווי דרייבר GAL4 רבים; יש לייעל את משך ההלם עבור כל נהג וניסוי (ייתכן שיהיה צורך בזמני הלם חום קצרים או ארוכים יותר).
- לאחר הלם החום, הניחו את הבקבוקונים בצורה אופקית על הספסל למשך מספר דקות על מנת לאפשר לזבובים להתאושש מהלם החום.
הערה: אין צורך להחליף את הבקבוקונים.
- שמור על הזבובים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ונתח אותם (ראה שלב 3 ו-4) יומיים או יותר לאחר מכת החום לביטוי מדווח אופטימלי
.
3. הכנה לדיסקציה ופתרונות
- ביום הדיסקציה, הכינו תמיסת קיבוע טרייה בצינורות PCR של 200 מיקרוליטר על ידי ערבוב של 180 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים S2 עם 20 מיקרוליטר של 20% פרפורמלדהיד (PFA) לקבלת תמיסת PFA של 2%. שמור על תמיסת הקיבוע על קרח לפני ובמהלך הדיסקציה.
זהירות: PFA רעיל ויש לטפל בו בזהירות.
הערה: מערבבים 160 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים S2 עם 40 מיקרוליטר של 20% פרפורמלדהיד (PFA) בצינור תגובת שרשרת פולימראז (PCR) של 200 מיקרוליטר להכנת תמיסת PFA של 4% במקום תמיסה של 2%.
- השתמש בצינור PCR אחד לכל גנוטיפ עם מקסימום 8-10 מוחות לכל שפופרת לתוצאות צביעה מיטביות.
- הכינו את תמיסת שטיפת המוח למבוגרים: 0.5% אלבומין בסרום בקר, 0.5% טריטון X-100 בתמיסת מלח עם פוספט (PBS).
הערה: בהתאם לצביעה, ייתכן שיהיה צורך בתמיסה המכילה 1% טריטון X-100. ריכוז גבוה יותר של טריטון X-100 מגביר את חדירת הנוגדן לרקמה ויש צורך לצבוע אזורים הנמצאים עמוק בתוך הרקמה (למשל, אזורים סינפטיים במוח הבוגר של דרוזופילה).
- הכינו את התמיסה החוסמת: 3% סרום עיזים רגיל, 3% סרום חמור רגיל ו-0.5% טריטון X-100 ב-PBS.
- ניתן לאחסן את תמיסת שטיפת המוח למבוגרים ואת תמיסת החסימה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
- הניחו צלחת זכוכית של בארות שקע עמוק על קרח ומלאו כל באר בפתרונות הבאים: אחד עם 70% אתנול, אחד עם PBS ואחד עם מדיום תרבית תאים S2.
4. דיסקציה של מוח מבוגר
- מקם צלחת ניתוח של 3 ס"מ על במת סטריאומיקרוסקופ ומלא אותה במדיום תרבית תאי S2 קר. בצע את כל הדיסקציות במדיום זה כדי להבטיח שהרקמה תישאר בריאה במהלך הליך הדיסקציה.
הערה: השתמש בכלי חיתוך מרופד בכמה מילימטרים של סיליקון שחור המספק ניגודיות רקע טובה (בתמונות), ושמור על המלקחיים במהלך הדיסקציה.
- להרדים את הזבובים של הגנוטיפ הרצוי עם CO2.
- בעזרת מלקחיים, תפסו את הזבוב בכנפיים ושטפו אותו באתנול 70% קר למשך 30 שניות, ואז עם PBS קר למשך 30 שניות נוספות.
- העבירו את הזבוב לבאר השקע העמוקה המלאה במדיום תרבית תאי S2.
- חזור על אותו הליך עבור כל הזבובים מאותו גנוטיפ ושמור אותם במדיום תרבית תאי S2 קר עד לדיסקציה, שתשמר את הרקמה.
הערה: הרדמו רק את מספר הזבובים שניתן לנתח בפרק זמן של כ-30 דקות. זמני דגירה ארוכים במדיום תרבית תאי S2 עלולים לפגוע ברקמה.
- תפסו את הזבוב בעזרת מלקחיים ותחת סטריאומיקרוסקופ, טבלו את הזבוב במדיום תרבית תאי S2.
- נתק את הראש משאר הגוף. השליכו את הגוף והשאירו את הראש שקוע במדיום תרבית תאי S2. חשוב ביותר להחזיק את הראש במלקחיים לאורך כל הדיסקציה. אם הראש יתחיל לצוף, יהיה קשה לשלוף אותו מבלי לפגוע ברקמה.
- התחל את הדיסקציה על ידי שליפת עין אחת, תוך החזקת הראש עם לפחות מלקחיים אחד בכל עת. ודא שקצה המלקחיים נמצא ממש מתחת לרשתית כדי למנוע נזק לרקמה שמתחתיה. משוך החוצה את העין השנייה והתחל להסיר את הקוטיקולה עד להופעת המוח.
- הסר את כל רקמת קנה הנשימה והקוטיקולה סביב המוח עד שהרקמה נראית נקייה. הקפד להסיר את כל רקמת קנה הנשימה סביב המוח לקבלת תוצאות צביעה מיטביות; הרקמות מוכנות כעת לקיבוע ולהכתמה.
- שמור את כל המוחות המנותחים במדיום תרבית תאי S2 קר לפני העברתם לתמיסת PFA על מנת לתזמן את שלב הקיבוע.
5. צביעת מוח למבוגרים
- העבירו את המוח המבודד עם פיפטה P10 לתמיסת PFA בטמפרטורת החדר (RT). כדי למנוע נזק לרקמות, לעולם אל תשתמש במלקחיים להעברת המוח לאחר הדיסקציה. בצע את כל השלבים בצינורות PCR של 200 מיקרוליטר על נוטר.
- לכל השלבים, לפני שזורקים את התמיסה הישנה עם פיפטה P200, אפשרו למוח להתיישב בתחתית הצינור. נסה להסיר את הסופרנטנט מבלי לשאוב את הרקמה. הגן על הרקמה מפני חשיפה לאור.
- תקן את המוח ב -200 מיקרוליטר של 2% PFA במדיום תרבית תאים S2 למשך שעה אחת או ב -4% PFA למשך 30 דקות. שמור על זמני קיבוע זהים בין הדגימות על מנת להגדיל את יכולת השחזור.
- לאחר 3 (או יותר) שטיפות של 15 דקות כל אחת ב -200 מיקרוליטר של תמיסת שטיפת מוח למבוגרים, חסום את הרקמות עם 200 מיקרוליטר של תמיסת חסימה למשך 30 דקות. זמני דגירה ארוכים יותר בתמיסת חסימה אפשריים.
- דגרו על המוח למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם נוגדנים ראשוניים מדוללים בתמיסת שטיפת מוח למבוגרים בנפח כולל של 200 מיקרוליטר.
הערה: זמני הדגירה עשויים להשתנות בהתאם לסוג הנוגדן בו נעשה שימוש. ייתכן שיהיה צורך בדגירות ארוכות יותר.
- לסימון שלושת סמני ה-MCFO, דגרו את המוחות עם נוגדנים ראשוניים נגד HA (1:500), אנטי-FLAG (אפיטופ DYKDDDDK) (1:100) ואנטי-V5.
- ניתן להשתמש בנוגדנים ראשוניים מצומדים ישירות במקום השילוב הראשוני + המשני הרגיל (למשל, anti-V5:DyLight 549 (1:200)). במקרה זה, התייחס לנוגדנים המצומדים ישירות כנוגדנים משניים.
הערה: עבור כל גנוטיפ, שמור כמה מוחות כבקרות כדי לאמת את הספציפיות של הצביעה. דלג על הדגירה הראשונית של הנוגדנים ועבור ישירות לשלב הבא.
- שטפו את הרקמות 3 פעמים למשך שעה אחת מתוך 200 מיקרוליטר של תמיסת שטיפת מוח למבוגרים (שלב 3.3) ודגרו אותן עם נוגדנים מצומדים פלואורופוריים משניים/ראשוניים מצומדים ישירות מדוללים בתמיסת שטיפת מוח למבוגרים למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס או למשך 4 שעות ב-RT, בנפח כולל של 200 מיקרוליטר
הערה: דוגמאות לנוגדנים מתאימים: נוגדנים מצומדים AlexaFluor 488 (1:250), anti-V5:DyLight 549 (1:200) ו-DyLight 647 (1:100).
- שטפו את המוח 3 פעמים למשך שעה אחת מתוך 200 מיקרוליטר של תמיסת שטיפת מוח למבוגרים, ולאחר מכן שטיפה אחרונה ב-200 מיקרוליטר של PBS למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס או למשך 1-2 שעות ב-RT; שלב הכביסה האחרון ב-PBS מסיר כל עקבות של Triton X-100 והוא הכרחי לתוצאות צביעה מיטביות. הרכיב את המוח במדיום הרכבה עם חומר נגד דהייה על כיסויי זכוכית.
6. הרכבה של מוחות להדמיה
- חתוך מרווח הדמיה לגודל המתאים באמצעות מספריים. למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה, סנדוויץ' את הדגימה ואת מרווח ההדמיה בין שני כיסויי זכוכית.
הערה: מרווחי הדמיה הם מרווחי דבק דקים (בעובי 0.12 מ"מ) המתקלפים ונדבקים לכיסויי זכוכית או לשקופיות מיקרוסקופ, ומאפשרים הרכבה של דגימות ללא דחיסה.
- בעזרת מלקחיים, הסר את תוחם הדבק ממשטח אחד והחל את המרווח, הצד הדביק כלפי מטה, על פני כיסוי זכוכית (22 מ"מ x 60 מ"מ). החל 10 מיקרוליטר של מדיום הרכבה על כיסוי זכוכית חדש.
- בעזרת פיפטה P10, העבירו את המוח מצינור 200 מיקרוליטר לכיסוי, ליד טיפת מדיום ההרכבה. יחד עם הרקמות, העבירו חלק מה-PBS על מנת לשמור על המוח בתמיסה.
- בעזרת פיפטה P10, העבירו את המוח מה-PBS לטיפה של אמצעי ההרכבה בניסיון להגביל את כמות ה-PBS. העבר את הדגימות במדיום הרכבה על הכיסוי עם מרווח ההדמיה. השתמש במספיק אמצעי הרכבה כדי לכסות את הדגימה.
- הסר את תוחם הדבק השני מהצד העליון של המרווח והוסף כיסוי זכוכית על גבי הדגימות. בעזרת קצה מלקחיים, הפעל לחץ עדין על אזור הדבק כדי לאטום. צלם את הרקמות המותקנות מיד או אחסן את השקופיות ב-20 מעלות צלזיוס לניתוח מאוחר יותר.
