הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

העברה מיטוכונדריאלית בסיוע צנטריפוגה לתאי גזע גליובלסטומה

867 צפיות

⸱

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

מקור: Mombo, B. N., et al. MitoCeption: העברת מיטוכונדריה MSC אנושית מבודדת לתאי גזע של גליובלסטומה. J. Vis. Exp. (2017)

בסרטון זה, מודגמת שיטה המאפשרת העברה של מיטוכונדריה עם תווית פלואורסצנטית לתאי גזע של גליובלסטומה (GSCs) באמצעות צנטריפוגה. הקליטה המוצלחת והאינטגרציה התפקודית של המיטוכונדריה התורמת מאושרות על ידי זיהוי הפלואורסצ באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

פרוטוקול

יום 1

1. תיוג של המיטוכונדריה של תאי גזע מזנכימליים (MSC)

  1. יומיים לפני הכנת המיטוכונדריה, זרעו MSCs אנושיים בצלחת 100 מ"מ, ב-10 מ"ל (Minimum Essential Medium Eagle)/FBS (סרום בקר עוברי) 10%, כך שיהיו 4 x 105 MSCs בתרבית ביום הראשון.
  2. שטפו MSCs עם PBS (4 מ"ל) והוסיפו 4 מ"ל αMEM/FBS 1% (מחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס).
  3. הוסף את הכמות הנדרשת של צבע חיוני של מיטוכונדריה ודגר תאים למשך 30 דקות בחממה של 37 מעלות צלזיוס.
  4. יש להסיר את תמיסת הצבע של המיטוכונדריה, לשטוף את התאים פעמיים עם 4 מ"ל αMEM/FBS מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) 1% ולהוסיף בחזרה 4 מ"ל αMEM/FBS 10%. דגירה של תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  5. החלף את מדיום התרבית (10 מ"ל αMEM/FBS 10%) לאחר 30 דקות, ובפעם אחרת, שעתיים לאחר מכן.

יום 1

2. תיוג תאי הגזע של גליובלסטומה (GSC)

  1. Dissociate GSCs קו תאים Gb4 (10 x 106 תאים) גדל כנוירוספרות על צלוחיות תרבית תאים מצופות פולי-HEMA
  2. זרעי GSCs בצלחת של 48 בארות ב-105 תאים/באר במדיום התפשטות GSC (500 מיקרוליטר) (ראה טבלה 1).
  3. צנטריפוגה את הצלחת ב-270 x גרם למשך 5 דקות ב-20 מעלות צלזיוס.
  4. יש להוסיף את הכמות הנדרשת של צבע חיוני לתאים ולדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  5. הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום בסיסי GSC (טבלה 1) לכל באר של צלחת 48 הבארות.
  6. צנטריפוגה את הצלחת ב-270 x גרם ב-20 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. שאפו את הסופרנטנט.
  7. חזור על שלבים 2.5 עד 2.6.
  8. מוסיפים 500 מיקרוליטר של מדיום בסיסי GSC ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  9. צנטריפוגה את הצלחת ב-270 x גרם ב-20 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. שאפו את הסופרנטנט.
  10. הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום התפשטות GSC לכל באר של צלחת 48 הבארות ודגר בחממה של 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: כמות ה-GSCs המצוינת (10 x 106 תאים) מאפשרת לבצע את ניסויי המינון-תגובה השונים ואת בקרות ה-FACS. ברגע שתנאי הניסוי מוגדרים בצורה מדויקת יותר, ניתן להקטין את הכמות הזו.

3. זריעה של תאי גזע גליובלסטומה

  1. אסוף את הנוירוספירות GSC (תאי גזע גליובלסטומה) (10 x 106) על ידי צנטריפוגה ב-270 x g למשך 5 דקות, ב-20 מעלות צלזיוס בשפופרת של 50 מ"ל.
  2. שטפו תאים עם 5 מ"ל HBSS (תמיסת המלח המאוזנת של הנקס), וצנטריפוגה ב-270 x גרם למשך 5 דקות ב-20 מעלות צלזיוס.
  3. שאפו את הסופרנטנט.
  4. השעו בעדינות את גלולת ה-GSC ב-100 מיקרוליטר טריפסין-EDTA (חומצה אתילנדיאמין טטראצטית) (0.25%) (לכל 10 x 106 תאים)
  5. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות.
  6. הוסף 10 מיקרוליטר CaCl2 (20 מ"מ) ו-2 מיקרוליטר DNase I (10 מ"ג/מ"ל).
  7. נתק את הנוירוספרות על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה (פי 30-50) עם פיפטה P200. הימנע מבועות. בדוק תחת המיקרוסקופ שכל ה- GSCs מנותקים.
  8. הוסף 10 מיקרוליטר מעכב טריפסין (5%) ו-10 מ"ל HBSS.
  9. צנטריפוגות GSC ב-270 x גרם למשך 7 דקות ב-20 מעלות צלזיוס.
  10. זורקים את הסופרנטנט ומוסיפים 10 מ"ל GSC בינוני בסיסי.
  11. ספור GSCs עם תא ספירה של תומא ולאחר מכן צנטריפוגה את התאים ב-270 x g למשך 7 דקות ב-20 מעלות צלזיוס.
  12. הוסף את הנפח המתאים של מדיום התפשטות GSC כדי להגיע לריכוז הסלולרי של 106 GSCs/ml.
  13. זרע 105 GSCs (100 מיקרוליטר של תרחיף התא) לכל באר של צלחת של 96 בארות.
  14. צנטריפוגה את הצלחות ב-270 x גרם למשך 7 דקות ב-20 מעלות צלזיוס כדי לקבל GSCs בתחתית הבארות.
  15. דגרו את צלחת 96 הבארות ב-37 מעלות צלזיוס.

יום 2

4. MSC (תאי גזע מזנכימליים) בידוד מיטוכונדריה

  1. כוונן את טמפרטורת הצנטריפוגה של המיקרו-צינור ל-4 מעלות צלזיוס.
  2. הכן שני צינורות של 1.5 מ"ל "A" ו-"C" המכילים את הריאגנטים למיצוי המיטוכונדריה (200 מיקרוליטר ריאגנט A ו-400 מיקרוליטר מגיב C, שניהם מכילים את מעכבי הפרוטאז ללא EDTA). הכן 2 צינורות נוספים, המסומנים "MSC" ו- "מיטו". שמור את כל הצינורות על קרח. הכינו גם צינורות לדילולים סדרתיים של המיטוכונדריה.
  3. שטפו MSCs עם 10 מ"ל PBS מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) (מי מלח עם חוצץ פוספט).
  4. שטפו MSCs עם 2 מ"ל טריפסין (ללא EDTA) למשך 10 שניות והוסיפו 1 מ"ל טריפסין (ללא EDTA). דגירה של תאים למשך 5-10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  5. שחזר את MSCs על ידי הוספת 10 מ"ל αMEM / FBS 10%, העבר לשפופרת של 50 מ"ל.
  6. תאי צנטריפוגה ב-270 x גרם למשך 5 דקות ב-20 מעלות צלזיוס.
  7. יש להשליך את הסופרנטנט ולהוסיף 10 מ"ל αMEM/FBS 10% לכדורית התא.
  8. ספרו את ה-MSCs עם תא ספירה של Malassez.
  9. צנטריפוגות MSCs (4-5 x 105) ב-270 x g למשך 5 דקות ב-20 מעלות צלזיוס.
  10. השליכו את הסופרנטנט, הוסיפו 1 מ' αMEM/FBS קר כקרח 10% לכדור התא והעבירו את התאים לצינור המסומן "MSC". שמור את הצינור על קרח.
  11. צנטריפוגה את הצינור המכיל את ה-MSCs ב-900 x g למשך 5 דקות, ב-4 מעלות צלזיוס.
  12. הסר את כל שאריות המדיום מהצינור.
  13. הוסף 200 מיקרוליטר של ריאגנט בידוד מיטוכונדריה A (המכיל את מעכבי הפרוטאז ללא EDTA). מערבולת במהירות בינונית למשך 5 שניות ומשאירה את הצינורות על הקרח למשך 2 דקות בדיוק.
  14. הוסף 2.5 מיקרוליטר של מגיב בידוד מיטוכונדריה B. מערבולת במהירות מקסימלית למשך 10 שניות, ולאחר מכן השאר צינורות על קרח. חזור על הפעולה כל 30 שניות למשך 5 דקות.
  15. הוסף 200 מיקרוליטר של מגיב בידוד מיטוכונדריה C (המכיל את מעכבי הפרוטאז ללא EDTA). מערבבים על ידי הטיית הצינור (בערך 30 פעמים, אין מערבולת). צנטריפוגה של הצינור ב-700 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  16. העבירו את הסופרנטנט (המכיל את המיטוכונדריה של MSC) לצינור "מיטו".
  17. צנטריפוגה ב-3,000 x גרם, 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, כדי לקבל את כדור המיטוכונדריה. השליכו את הסופרנטנט. הגלולה מכילה את המיטוכונדריה המבודדת.
  18. שוטפים את כדור המיטוכונדריה עם 200 מיקרוליטר של המגיב C. לאחר מכן, צנטריפוגה ב-12,000 x גרם, 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, כדי לקבל את כדור המיטוכונדריה.

5. העברה של מיטוכונדריה MSC מבודדת ל-GSCs (MitoCeption)

  1. הוסף 200 מיקרוליטר של מדיום התפשטות GSC מקורר מראש (0 מעלות צלזיוס) לכדור המיטוכונדריה המבודד מ-MSCs (4 x 105).
  2. יש לדלל את תכשיר המיטוכונדריה (בתווך התפשטות GSC) כדי להוסיף באופן עקבי 20 מיקרוליטר של תרחיף מיטוכונדריאלי ל-GSCs.
  3. הוסף את נפח המיטוכונדריה המבודדת לבארות של צלחת 96 הבארות המכילה את ה- GSCs , בריכוז הרצוי (0.1 עד 10 מיקרוגרם). מוסיפים את המיטוכונדריה לאט, קרוב לתחתית הבאר, מכסים את כל המשטח לפחות פעם אחת.
  4. צנטריפוגה, צלחת 96 הבארות המכילה את ה-GSCs של מקבל המיטוכונדריה עם המיטוכונדריה MSC ולוחית הבקרה ב-1,500 x g למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  5. מניחים את צלחות התרבות בחממת התאים של 37 מעלות צלזיוס מיד לאחר הצנטריפוגה.
    הערה: פרוטוקול העברת המיטוכונדריה מסתמך על צנטריפוגה של תרחיף המיטוכונדריה על התאים המתורבתים בכוח צנטריפוגה מתאים, עם מספר צנטריפוגות הניתנות להתאמה בהתאם למערכת התאים התורמים/מקבלי המיטוכונדריה.

טבלה 1: מדיה תרבותית.

מדיום תרבית תאיםקומפוזיציה
מדיום בסיסי GSCDMEM/F-12 בתוספת
אינסולין 20 מ"ג/מ"ל
תוספת N2 1x
גלוקוז 3 גרם/ליטר
L-גלוטמין 2 מ"מ
מדיום התפשטות GSCהוסף למדיום הבסיסי:
B27 supplement 1x
EGF 10 ng/ml
bFGF 10 ng/ml
פטריות 10 מ"ג/מ"ל
Fungizone 0.25 מ"ג/מ"ל
הפרין 2 מ"ג /מ"ל
ציפרופלוקסצין 2 מיקרוגרם / מ"ל
גנטמיצין 2 מיקרוגרם/מ"ל
מדיום התפשטות MSCαMEM בתוספת
L-גלוטמין 2 מ"מ
10% FBS
bFGF 2 ng/ml

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

figure-results-1
איור 1: זרימת עבודה עבור העברה של מיטוכונדריה MSC מבודדת ל-GSCs על ידי MitoCeption. מוצגים 7 השלבים ל-MitoCeption של מיטוכונדריה MSC ל-GSCs וניתוחי ה-GSC הבאים. מספרי השלבים מצוינים כמו בסעיף הפרוטוקול. אם לא מבוצעת תיוג MSC ו-GSC, באשר לניתוחים פונקציונליים, ניתן להשמיט את שלבים 1 ו-2, וניתן לעקוב אחר הפרוטוקול מהיום השני ואילך. תמונות ניגודיות פאזה מייצגות Gb4 GSCs כנוירוספרות (יום 1), כתרבית חד-תא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת בידוד מיטוכונדריה לרקמותפישר סיינטיפיק10579663
תוספת N-2 (פי 100)פישר סיינטיפיק11520536
תוספת B-27 W/O VIT A (50X)פישר סיינטיפיק11500446
HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+סיגמאH4385
פולי הםסיגמאP3932
aMEM עם גלוטמיןאוזיםBE12-169F
DMEM/F-12 ללא גלוטמין,פישר סיינטיפיק11540566
L-גלוטמיןInvitrogen25030-024
גלוקוזסיגמאG7021
InsulineסיגמאI 1882
bFGF אנושימערכות מו"פ233-FB-025
EGF אנושיפפרוטקAF-100-15
הפריןסיגמאH3149
CaCl2מרק2382
מעכב טריפסיןסיגמאT9003
DNase ISIGMA10104159001
טריפסין 0.25% /EDTA 1 mMInvitrogen25200056
טריפסיןגיבקו15090-046
מעכבי פרוטאז EDTA freeסיגמא4693159001
ציפרופלוקסציןסיגמא17850-5G-F
פונגינהInvivogenant-fn-1
אזור הפטריותתרמופישר15290018
גנטמיציןיורומדקסEU0410
MitoTracker ירוק FMבדיקות מולקולריותM7514
MitoTracker אדום CMXRosבדיקות מולקולריותM7512
MitoTracker אדום עמוק FMבדיקות מולקולריותM22426
CellTracker ירוק CMFDAבדיקות מולקולריותC7025
CellTracker כחול CMF2HCבדיקות מולקולריותC12881
ריפהסנטה קרוזSC-24948
צלחת תרבית סטרילית פלואורודישמכשירי דיוק עולמייםFD35-100
המציטומטרפישר סיינטיפיק267110
צינורות FACSבקמן קולטר25,23,749
מנגנון FACSגליוס3L 10C
LC FAST START DNA MASTER PLUSרוש3515885001

גלה מאמרים נוספים

שיטת סבוב (צנטריפוגציה)מיקרוסקופיה קונפוקליתסימון פלואורסצנטיקליטה תאיתבידוד מיטוכונדריהגילוי פלואורסצנציהתרבית תאיםפרוליפרציה של GSC
העברה מיטוכונדריאלית בסיוע צנטריפוגה לתאי גזע גליובלסטומה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.