צביעה פלואורסצנטית של תאי פסגה עצבית שגודלו על הידרוג'לים בעלי קשיחות משתנה

תקציר

מקור: Le, T. P., et al., מערכת O9-1/הידרוג'ל אופטימלית לחקר אותות מכניים בתאי פסגה עצבית. J. V. פקיעה (2021)

בסרטון זה, אנו מתארים את ההליך לביצוע צביעה פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להדגים צביעת פלואידין של תאי פסגה עצבית שגודלו על הידרוג'לים בעלי קשיחות משתנה כדי לדמיין ולנתח את ארגון השלד התאים.

פרוטוקול

1. ניתוח מולקולרי של נוקשות באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית

1. השתמש בפינצטה כדי להעביר את הכיסוי לצלחת חדשה כדי למזער אותות שווא מתאים הגדלים ישירות על הצלחת. שטפו את התאים עם 500 מיקרוליטר של PBS סטרילי שלוש פעמים כדי להסיר תאים מתים וכל מדיום תרבית שנותר.
2. תקן את התאים באמצעות 500 מיקרוליטר ללא הפרעה של 4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו מחדש את התאים שלוש פעמים באמצעות 500 מיקרוליטר PBS/באר למשך 2 דקות כל אחד.
   הערה: יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לעצירה פרוצדורלית.
3. טפל בתאים עם 500 מיקרוליטר של 0.1% טריטון X-100 למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את התאים שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר PBS/באר.
4. חסום את התאים עם 250 מיקרוליטר של 10% סרום חמור (מדולל ב-PBS ו-0.1% טווין 20) לבאר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
5. דגרו על התאים עם פלואידין המשמש לצביעה של F-actin בדילול של 1:400 ב-250 מיקרוליטר של 10% סרום חמור למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS למשך 5 דקות כל אחד.
   הערה: ניתן לדגור פלואידין 568 ננומטר עם נוגדנים משניים של 488 ננומטר או 647 ננומטר או בפני עצמו.
6. לדגור את התאים עם 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, דילול 1:1000) ב-250 מיקרוליטר של PBS למשך 10 דקות ולאחר מכן שטיפה אחרונה של PBS למשך 2 דקות.
7. הוסף 3-4 טיפות של מדיום הרכבה לכל באר. אחסן את הדגימות ב-4 מעלות צלזיוס להתייצבות למשך שעתיים לפחות לפני ההדמיה כדי לוודא שאמצעי ההרכבה הוגדר כהלכה.
8. בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, צלם תמונות של לפחות 3 פריימים אקראיים לכל דגימת הידרוג'ל, והפק ערוצים בודדים וממוזגים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2 מ"מ #1 קורנינג 0211 כיסוי זכוכית	Chemglass Life Sciences	CLS-1763-012
25 מ"מ #1 קורנינג 0211 כיסוי זכוכית	מדעי החיים של Chemglass	CLS-1763-025
צלחת תרבית תאים 4 בארות	תרמו סיינטיפיק	179830
4% פרפורמלדהיד	סיגמא אולדריץ'	J61899-AP
40% אקרילאמיד	סיגמא אולדריץ'	A4058
אלקסה פלואור 488 פלואידין	תרמו פישר	A12379
קולגן סוג I (100 מ"ג)	קורנינג	354236
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	תרמו פישר	D1306
נסיוב חמורים	סיגמא אולדריץ'	D9663
סטרילי 1x PBS	שיבוט	SH30256.02
מיקרוסקופ פלואורסצנטי	לייקה