$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבחינת אתיקה של בעלי חיים.
1. הכנת פתרונות העבודה והמאגרים
הערה: בבוקר הבדיקה, הכינו את הפתרונות הבאים. החישוב הזה מבוסס על הפתרונות הדרושים לעיבוד שני אזורים במוח (כלומר, קליפת המוח הקדם-מצחית [PFC] וההיפוקמפוס [HPC]) מ-12 עכברים.
- הכן נוזל מוחי מלאכותי (aCSF, pH = 7.4) כפי שהוזכר ב-טבלה 1. הוציאו 750 מיקרוליטר של aCSF לכל צינור דגימה, והניחו אותם בבלוק טמפרטורת המתכת על קרח כדי לקרר מראש את המאגר.
- הכן את מאגר הליזיס כפי שהוזכר ב-טבלה 2. יש לאחסן על קרח (400 מיקרוליטר לשימוש לכל דגימה).
- הכן תמיסת מלאי 52 מ"מ Bis (sulfosuccinimidyl) suberate או BS3 (26x) במאגר נתרן ציטראט של 5 מ"מ (pH = 5.0).
- ראשית, הכינו 100 מ"מ חומצת לימון (מלאי A) ו-100 מ"מ נתרן ציטראט (מלאי B).
- לדלל מלאי A ומלאי B ביחס של 1:20 עם מים נטולי יונים. הוסף 100 מיקרוליטר כל אחד ל-1.9 מ"ל מים להכנת 5 מ"מ חומצת לימון (מלאי C) ו-5 מ"מ נתרן ציטראט (מלאי D), בהתאמה.
- מערבבים 410 מיקרוליטר של מלאי C ו-590 מיקרוליטר של מלאי D להכנת מאגר נתרן ציטראט של 5 מ"מ (pH = 5.0) (תמיסה E, 1 מ"ל).
- אשר את ה-pH של תמיסה E באמצעות פס מחוון pH.
- ממיסים 24 מ"ג של BS3 ב-806.4 מיקרוליטר של תמיסה E על ידי מערבולת למשך 30 שניות להכנת תמיסת מלאי BS3 (פי 26).
- הכן עוד 1 מ"ל של תמיסה E לשימוש כבקרת רכב עבור הדגימות שאינן מקושרות.
הערה: הכינו את פתרון המניות של BS3 כשכל השאר מוכן, והניסוי עומד להתחיל. יש לאחסן את ה-BS3 מיובש ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. לאחר הבנייה מחדש, BS3 נשאר פעיל רק כ-≤3 שעות. מכיוון שדווח כי ה-pH של מאגר הנתרן ציטראט של 5 מ"מ (תמיסה E) עולה עם הזמן, וגורם להידרוליזה מואצת של BS3, מומלץ להכין את תמיסה E טרייה מתמיסות מלאי A ו-B. בשל המסיסות המוגבלת של BS3 בטמפרטורות נמוכות, יש לשמור את ה-BS3 המחודש ב-RT. השתמש ב-BS3 המחודש תוך 3 שעות, ואין להקפיא/להפשיר או לעשות שימוש חוזר ב-BS3 המחודש.
2. דיסקציה של רקמות מוח
הערה: משלב זה ואילך, לפחות שני אנשים צריכים לעבוד יחד בצורה מתואמת. בעוד שאדם אחד מתמקד בנתיחת החיה, האדם השני צריך לעבוד כשומר זמן ולעזור לתאם את הבדיקה.
- הביאו את החיה הראשונה לנתיחה מאזור הדיור לחדר הדיסקציה.
הערה: מכיוון שגורמי לחץ חריפים (למשל, סביבה חדשה, ריח של דם) עשויים להשפיע על הדינמיקה של חלבון המוח, יש להחזיק את בעלי החיים בכלובים הביתיים שלהם הממוקמים הרחק מאזור הנתיחה ולאחר מכן להביא אותם בנפרד לחדר הנתיחה לעריפת ראש מיידית.
- המתת חסד של העכבר על ידי פריקת צוואר הרחם ואחריה עריפת ראש. הוציאו את המוח במהירות מהגולגולת וטבלו אותו ב-PBS קר כקרח בצלחת פטרי למשך 10-15 שניות (איור 1).
הערה: החיות אינן מורדמות לניסויי BS3 מכיוון שכל חומר הרדמה יכול להשפיע על רמת ההצגה של קולטני המוליכים העצביים.
- מקמו את המוח המקורר בתוך מטריצת המוח על קרח, כשהצד הגחוני של המוח פונה כלפי מעלה (איור 2).
- הכניסו את סכין הגילוח הראשון דרך הגבול שבין פקעת הריח לבין פדונקל הריח כדי לחתוך את המוח באופן עטרתי (איור 3). בעזרת שלושה עד ארבעה סכיני גילוח נוספים, חתכו באופן סדרתי את החלק הקדמי של המוח במרווחים של 1 מ"מ.
- הרם את פרוסות העטרה ממטריצת המוח על ידי החזקת כל סכיני הגילוח המוכנסים יחד, והשאיר את החלק האחורי של המוח מאחור במטריצת המוח. השתמשו במלקחיים כדי להפריד את סכיני הגילוח זה מזה, והניחו אותם על המשטח השטוח והקריר כשפרוסת המוח פונה כלפי מעלה (איור 4).
- זהה את הפרוסות המכילות את אזור העניין. לדגימת ה-PFC, בחר את הפרוסות השנייה והשלישית מאחורי הפרוסה הראשונה המכילה את פדונקל הריח.
- הסר את אזור העניין באמצעות אגרוף רקמות, הניח אותו בצד על סכין הגילוח המצונן, וחלק את הרקמה באופן שווה לשניים (למשל, רקמות מההמיספרה השמאלית לעומת הימנית, כאשר חצי אחד ישמש לתגובת הצלבה BS3 והחצי השני לבקרה ללא קישור צולב אם חלבון המטרה המעניין מתבטא באופן שווה בשתי ההמיספרות).
- טחנו כל רקמה לחתיכות על סכין הגילוח באמצעות הקצה העדין של המלקחיים בתנועות אנכיות מרובות כנגד הלהב במקום לרסק או לטחון את הרקמות. זה ימקסם את שטח הפנים הנגיש ל-BS3 מבלי לפגוע קשות בשלמות הממברנה של התאים. מיד לאחר הטחינה, העבירו את הרקמות הטחונות לצינורות המתאימים (ראה שלב 3.3).
3. תגובת קישורים צולבים
- הביאו את החיה הבאה לדיסקציה מאזור הדיור לחדר הדיסקציה כאשר דיסקציה של המוח של העכבר הקודם עומדת להסתיים (שלב 2.10).
- ספייק את הצינור מקורר מראש על קרח עם 30 מיקרוליטר של תמיסת BS3 (26x) או תמיסת רכב E ממש לפני שהרקמות הטחונות מוכנות להעברה לצינורות המתאימים. החלף את קצות הפיפט בין הצינורות כדי להבטיח שאף BS3 לא מזוהם בצינורות הבקרה ללא הצלבה.
- העבירו את הרקמות הטחונות (משלב 2.8) לצינורות המתאימים, ואז התחילו לנתח את החיה הבאה (שלב 2.2).
- הפוך וערבב את הצינור כדי לפרק את גושי הרקמה לחתיכות קטנות יותר, והתחל לדגור את הדגימות על מסובב הצינור בחדר הקירור למשך 30 דקות עד שעתיים. רשום את זמן ההתחלה של דגירה BS3 עבור כל צינור. ראה סעיף הדיון לזמן הדגירה האופטימלי.
- להרוות את התגובה על ידי זינוק הצינור ב-78 מיקרוליטר של 1 M גליצין ולדגור עוד יותר את הדגימה למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס עם סיבוב קבוע. רשום את שעת ההתחלה והסיום של המרווה עבור כל צינור. המשך לסייע לאדם תוך התמקדות בנתיחת החיה על ידי הבאת החיה הבאה (שלב 3.1) ועזרה בהצלבה (שלב 3.2).
הערה: התייחסו לכל דגימה באותו זמן בדיוק בכל הדגימות. אם חדר הנתיחה רחוק מחדר הקירור, מומלץ מאוד לגייס אדם שלישי שישתתף בדגירה ובמרווה בחדר הקירור.
טבלה 1: הרכב נוזל המוח השדרתי המלאכותי.
| עובד conc. | פתרון מלאי | כמות של פתרון מלאי לחלוקה |
| 1.2 mM CaCl2 | 480 מ"מ (400x)* | 100 μL |
| 20 מ"מ HEPES | 1 מ (50x) | 800 μL |
| 147 mM NaCl | 5 מ (34x) | 1176.5 μL |
| 2.7 מ"מ KCl | 1.08 מ (400x) | 100 μL |
| 1 mM MgCl2 | 400 מ"מ (400x) | 100 μL |
| 10 מ"מ גלוקוז | 2.5 מ' (250x) | 160 μL |
| מים נטולי יונים | | 37.563 mL |
| סה"כ | | 40 מ"ל |
| * יש להכין מלאי CaCl2 טרי ביום הניסוי. |
טבלה 2: הרכב מאגר הליזיס
| עובד conc. | פתרון מלאי | כמות של תמיסת מלאי לחלוקה |
| 25 מ"מ HEPES | 1 מ (40x) | 500 μL |
| 500 מ"מ NaCl | 5 מ (10x) | 2 מ"ל |
| 2 מ"מ EDTA | 0.5 מ' (250x) | 80 μL |
| 1 מ"מ DTT | 1 מ (1000x) | 20 μL |
| 0.1% NP-40 | 10% (100x) | 200 μL |
| קוקטייל מעכב פרוטאז | 100x | 200 μL |
| מים נטולי יונים | | 17 מ"ל |
| סה"כ | | 20 מ"ל |
