הערכת ספיגת גלוקוז בתאי העצב המוטוריים של זחלי דרוזופילה עם חילוף חומרים מווסת של גלוקוז

תקציר

מקור: Loganathan, S., et al., מדידת ספיגת גלוקוז במודלים של Drosophila של חלבון TDP-43. J. Vis. Exp. (2021).

הסרטון מדגים טכניקה למדידת ספיגת הגלוקוז בתאי עצב מוטוריים של זחל Drosophila באמצעות חיישן גלוקוז תוך-תאי מבוסס העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית (FRET). לאחר ניתוח הזחלים כדי לחשוף את חוט העצב הגחוני, הנוירונים המוטוריים נראים דרך הקרינה הנפלטת על ידי הפלואורופור התורם של החיישן. כאשר מגורה עם גלוקוז, FRET בין התורם של החיישן לפלואורופורים המקבלים מפעיל את פליטת הקרינה מהמקבל, ומאפשר השוואה של ספיגת הגלוקוז בין זחלי בקרה לזחלים מוטנטיים עם חילוף חומרים מוגבר של גלוקוז.

פרוטוקול

1. Drosophila דיסקציות של חוט העצב הגחוני (VNC)

1. הכינו כלי חיתוך אלסטומר מסיליקון.
   1. יוצקים רכיבי אלסטומר סיליקון לצינור של 50 מ"ל כפי שמצוין בפרוטוקול היצרן ומערבבים היטב.
   2. ממלאים כלי תרבית רקמות 35 מ"מ בכ -2 מ"ל מתערובת האלסטומר. השתמש במזרק כדי להסיר בועות. מכסים את הכלים ומניחים אותם על משטח ישר בתנור 60 מעלות למשך הלילה לריפוי.
2. נתחו את זחלי Drosophila כדי לחשוף את ה-VNC תוך שמירה על כדאיות הרקמות.
   1. אספו זחל כוכב שלישי נודד, שטפו עם ddH₂O, ולאחר מכן הניחו אותו בטיפה של חוצץ דמוי המולימפה 3 (HL3) (70 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 20 מ"מ MgCl₂, 10 מ"מ NaHCO₃, 115 מ"מ סוכרוז, 5 מ"מ טרהלוז, 5 מ"מ הידרוקסיאתילפיפרזין אתאן חומצה סולפונית [HEPES]; pH 7.1) על צלחת מרופדת באלסטומר.
   2. בעזרת זוג מלקחיים (#5 או 55 מלקחיים) תחת מיקרוסקופ מנתח, הצמידו את הקצוות הקדמיים והאחוריים של הצד הגבי של הזחל כלפי מעלה, ומתחו בזהירות את הזחל לאורכו בעזרת סיכות חרקים (סיכות מינטין).
   3. בצע חתך ממש מעל הסיכה האחורית בעזרת זוג מספריים זוויתיים. בצע חתך אנכי החל מהחתך לכיוון הקצה הקדמי של הזחל.
   4. יש להוסיף כמה טיפות של חוצץ HL-3 במידת הצורך. הסר את קנה הנשימה ואת שאר האיברים הצפים מבלי להפריע למערכת העצבים המרכזית (CNS). הצמד את הדשים המותחים את דופן הגוף כדי לחשוף את מערכת העצבים המרכזית תוך שמירה על המערכת העצבית-שרירית (VNCs, אקסונים וצמתים עצביים-שריריים) שלמה.

2. רכישת תמונה

1. בצע אופטימיזציה של פרמטרי ההדמיה.
   1. הפעל את המיקרוסקופ והלייזרים לפני תחילת הניתוחים. יש לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף עם עדשת טבילה במים פי 40. השתמש בלייזר 405 ננומטר כדי לעורר חלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP) ולרכוש את התמונות הן בערוצי הזיהוי CFP (465-499 ננומטר) והן בערוצי הזיהוי FRET (535-695 ננומטר).
   2. מטב פרמטרי רכישה כגון מהירות סריקה (6), ממוצעת (2), מטרה (40x), זום (1x), גודל חור (1 AU) ורזולוציה מרחבית (512 x 512). כוונן את ההגבר כך שהאות יהיה בטווח הדינמי האופטימלי. יש להשתמש באותם פרמטרים עבור כל הגנוטיפים.
2. תמונה של נוירונים מוטוריים בתוך ה-VNC.
   1. מניחים את צלחת הסיליקון עם הדגימה המנותחת מתחת לעדשה. הורד את העדשה כך שתבוא במגע עם מאגר HL3 טרהלוז-סוכרוז. זה קריטי לוודא שהעדשה שקועה לחלוטין במאגר. הוסף עוד מאגר במידת הצורך.
   2. השתמש בערוצי CFP ו-FRET כדי לבחור באופן ידני קטע אופטי המורכב מלפחות 6 נוירונים מוטוריים במיקוד, הממוקמים לאורך קו האמצע של VNC. הנוירונים המוטוריים מזוהים על סמך ביטוי חיישן הגלוקוז ומיקומו לאורך הציר הקדמי-אחורי.
   3. רכוש תמונות כל 10 שניות למשך 10 דקות. תמונות אלה מייצגות את קו הבסיס.
3. יש לעורר עם תוסף גלוקוז HL-3.
   1. הסר את הטרהלוז-סוכרוז המכיל חוצץ HL3 באמצעות פיפטה של פסטר והחלף אותו ב-5 מ"מ גלוקוז בתוספת HL-3 (70 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 20 מ"מ MgCl₂, 10 מ"מ NaHCO₃, 115 מ"מ סוכרוז, 5 מ"מ גלוקוז, 5 מ"מ HEPES, pH 7.1). שלב זה צריך להתבצע בזהירות רבה, כדי להימנע ככל האפשר מתנועת ה- VNC.
   2. רכוש תמונות כל 10 שניות למשך 10 דקות נוספות. תמונות אלה מייצגות את שלב הגירוי.
4. שמור את התמונות כקובצי .czi או כל סוג קובץ הנתמך על-ידי תוכנת ההדמיה עם שם קובץ הכולל תאריך, רקע גנטי, מצב ניסוי (בסיס או גירוי) וערוצים שבהם נעשה שימוש.
5. שימוש חוזר בפרמטרים כדי לדמות את כל הגנוטיפים (איור 1A).

תוצאות

איור 1: ניתוח תמונה של חיישן גלוקוז בהקשר של מוטציה TDP-43. (A) תמונות מייצגות של אותות FRET ו-CFP בבקרות חיישני גלוקוז ודגימות TDP-43^G298S בתנאי בסיס וגירוי. נוירון מוטורי מייצג מתואר בכל תמונה כדוגמה להחזר ROI. פסי קנה מידה: 20 מיקרומטר. הגדלה: 40x. (B) היחסים הממוצעים של FRET/CFP בחיישן גלוקוז ובתאי עצב מוטוריים מוטנטיים TDP-43 במשך 20 דקות של הדמיה. הי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
35 מ"מ כלי תרבית רקמה	סיגמא אולדריץ'	CLS430165
עדשת טבילה במים 40X	צייס	440090	dippable, N.A. 0.8
מספריים לניתוח	רובוז	RS-5618
דומונט #5 מלקחיים	VWR	100189-236
דומונט #55 מלקחיים	VWR	100189-244
סיכות קטנות	כלים למדע עדין	26002-10	משמש לנתיחות
ערכת אלסטומר סיליקון SYLGARD 184	Dow	1317318
Zeiss LSM880 NLO מיקרוסקופ מולטיפוטון/קונפוקלי זקוף	צייס	לא ישים