$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.
1. צביעה חיסונית
הערה: בצע את כל השטיפות והדגירה על שייקר פלטפורמה מסלולית המוגדר לכ-100 סל"ד. כל השלבים מבוצעים בטמפרטורת החדר, למעט הדגירה הראשונית של הנוגדנים, המתבצעת ב-4 מעלות צלזיוס. יש להגן מפני אור ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודשיים. אם האות הפלואורסצנטי האנדוגני מספיק להדמיה וניתוח ללא צורך בצביעה חיסונית, ניתן לדלג על שלבים 1.1-1.9. אם מדלגים על צביעה חיסונית, בצעו שלוש שטיפות של 10 דקות ב-TBS והמשיכו לשלב 1.10.
- הכן תמיסה טרייה של TBST (0.2% טריטון ב-TBS) על ידי הוספת 1 מ"ל של 10% טריטון-X לצינור של 50 מ"ל ומילוי הצינור ל-50 מ"ל ב-1x TBS. הכן 2 מ"ל של תמיסות חסימה ונוגדנים (10% סרום עיזים ב-TBST) לכל מוח.
הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הכינו TBST חדש עבור כל ניסוי צביעה חדש והשתמשו במקור איכותי של 10% Triton-X מימי ( טבלת חומרים).
- סמן צלחת של 24 בארות בהתאם לסכימה (איור 1). מקם דוגמאות שונות בשורות שונות ופתרונות שונים בעמודות שונות. הוסף 1 מ"ל TBST לשלושת העמודות הראשונות ('Wash 1', 'Wash 2' ו-'Wash 3'). הוסף 1 מ"ל של תמיסת חסימה לעמודה הרביעית.
- הכן קיסם זכוכית על ידי המסת קצה פיפט פסטר 5.75 לוו קטן באמצעות מבער בונסן . השתמש בבחירה זו כדי להעביר קטעי רקמות מצלחת 12 הבארות לעמודת הכביסה 1 של צלחת 24 הבארות.
הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, סנן את הקטעים לפני תחילת הצביעה. כדי לסנן קטעים, העבירו את החלקים בזה אחר זה לצלחת פטרי מלאה ב-1x TBS ובחנו את החלקים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מטרה של פי 5 או פי 10 כדי לוודא שיש מספר מספיק של תאים מסומנים פלואורסצנטיים. מומלץ לצבוע ארבעה עד שישה חלקים לבאר, אם כי ניתן להכתים עד שמונה חלקים לבאר במידת הצורך.
- שטפו את החלקים במשך 10 דקות כל אחד בשטיפה 1, 2 ו-3 בארות, ולאחר מכן דגרו אותם למשך שעה בתמיסת החסימה. השתמש בפיק הזכוכית כדי להעביר את החלקים מבאר אחת לאחרת. ניתן להשתמש בבחירה כדי להעביר מספר חלקי מוח בבת אחת.
- הכן 1 מ"ל של תמיסת נוגדנים ראשונית לכל דגימה (למשל, ארנב RFP 1:2000 או עוף GFP 1:2000). הוסף את הנוגדן לתמיסת הנוגדנים, מערבולת קצרה, ולאחר מכן צנטריפוגה למשך 5 דקות בטמפרטורה ≥ 4,000 x g ב-4 מעלות צלזיוס. דגור על החלקים בנוגדנים ראשוניים במשך שניים עד שלושה לילות ב-4 מעלות צלזיוס תוך כדי טלטול.
- לאחר הדגירה הראשונית של הנוגדנים, יש לשאוב את ה-TBST של היום הראשון מבארות השטיפה, להוסיף 1 מ"ל של TBST חדש לכל באר כביסה, ולהעביר את החלקים לבאר הכביסה הראשונה. שטפו את החלקים 3 פעמים למשך 10 דקות כל אחד.
הערה: לשאיפה, השתמש בצינור פסטר בגודל 9 אינץ' המחובר עם צינורות לבקבוק ואקום. קווי ואקום ביתיים או משאבת ואקום חשמלית יכולים לשמש כמקור ואקום.
- בזמן שטיפת החלקים, הכינו תמיסות נוגדנים משניות בריכוז של 1:200 על ידי הוספת נוגדנים לתמיסת הנוגדנים (למשל, נגד ארנב עז 594 או נגד תרנגולת עיזים 488). מערבולת קצרה, ואז סובב במשך 5 דקות ב-4,000 x ≥ g ב-4 מעלות צלזיוס.
- דגירה של חלקים בנוגדנים משניים למשך 3 שעות בטמפרטורת החדר. הגן על החלקים מפני אור במהלך שלב זה וכל השלבים הבאים כדי להפחית את ההלבנה של הנוגדנים המשניים.
- לאחר דגירה משנית של נוגדנים, יש לשאוב את ה-TBST של היום השני מבארות השטיפה, להוסיף 1 מ"ל של TBST חדש לכל באר כביסה, ולהעביר את החלקים לבאר הכביסה הראשונה. שטפו את החלקים 3 פעמים ב-TBST למשך 10 דקות כל אחד.
- במהלך הכביסה הסופית, הוציאו את אמצעי ההרכבה מ-4 מעלות צלזיוס והניחו לו להתחמם לטמפרטורת החדר. מכינים תערובת של 2:1 של 1x כף:מים מזוקקים ומוסיפים את זה לצלחת פטרי. הכן שקופית מיקרוסקופ על ידי הוספת 800 מיקרוליטר של 2:1 TBS:dH2O לפני השטח.
הערה: מומלץ מאוד להשתמש במדיית הרכבה שאינה מרפאת. התקשות אמצעי הרכבה יכולה לשנות את נפח הרקמה מה שעלול לבלבל את הניתוח של נפח הטריטוריה של האסטרוציטים. מתכון למדיית הרכבה ביתית פשוטה וזולה מסופק ב-טבלת החומרים.
- בעזרת מכחול עדין, העבירו את החלקים בזה אחר זה מבאר ה-Wash 3 לצלחת הפטרי. שלב זה מסיר את הטריטון ועוזר לחלקים להשתטח. לאחר מכן, העבירו את החלקים מצלחת הפטרי לנוזל שעל המגלשה.
- השתמש במכחול כדי לעזור לסדר את החלקים כך שיהיו שטוחים בשקופית. הסר בזהירות עודפי נוזלים מהמגלשה בעזרת פיפט P1000, ואחריו שאיבת ואקום.
הערה: הוסף קצה פיפט P200 לקצה פיפט פסטר לשליטה עדינה יותר בשאיבת הוואקום.
- לאחר הסרת כל הנוזלים העודפים מהמגלשה, השתמש בצינור העברה כדי להוסיף מיד טיפה אחת של אמצעי הרכבה לכל חלק ולהניח בעדינות כיסוי מעל השקופית. אפשר למדיית ההרכבה להתפשט למשך מספר דקות, ולאחר מכן הסר את כל אמצעי ההרכבה העודף שיוצא מתחת לכיסוי על ידי שאיבת ואקום.
הערה: אל תאפשר לחלקים להתייבש בכל עת לפני הוספת אמצעי ההרכבה. אם החלקים מתחילים להתייבש לפני הוספת אמצעי הרכבה, הדבר עלול להשפיע על נפח הרקמה ולהפריע לאיסוף נתונים מדויקים.
- אטמו את כל ארבעת הקצוות של הכיסוי עם לק שקוף. הניחו לשקופיות להתייבש במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן אחסנו אותן שטוחות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. המתינו לפחות שעתיים לפני הצילום, או צלמו למחרת.
הערה: קטעים מוכתמים בנוגדנים נגד GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) ו-RFP (חלבון פלואורסצנטי אדום) ניתן לאחסן עד שבועיים לפני ההדמיה, בתנאי שהם אטומים לחלוטין עם לק.
