$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות ה-IRB של המכון.
1. רקמת חתך
- חותכים חתיכה קטנה מהרקמה (~1 ס"מ על 1 ס"מ) לחתך. מחזירים את הטישו הנותר למקפיא יבש/-80 מעלות צלזיוס.
הערה: ודא שקטע הרקמה הוא ~95% קליפת המוח הקטן, שם נמצאים תאי פורקינג'ה.
- הניחו תלולית OCT בגובה של כ-3 מ"מ כדי לכסות את ה'צ'אק'. התחל בבניית השכבות מלמעלה בתנועה איטית ומעגלית עד שתהיה תלולית קטנה.
- לאחר שה-OCT קפוא חלקית אך עדיין יש מעט נוזל במרכזו, הניחו עליו את הטישו. אל תדחפו את הרקמה עמוק לתוך ה-OCT. הניחו לטישו לשבת עליו עד להקפאה מלאה, מה שייקח 1-2 דקות.
- הנח את ה'צ'אק' עם OCT קפוא ואת הרקמה לתוך זרוע החיתוך של הקריוסטט. כוונן את הרקמה כך שהיא תהיה צמודה עם להב החיתוך.
- הניחו לרקמה לשבת בזרוע החיתוך למשך 15-20 דקות כדי להסתגל לטמפרטורה החדשה.
הערה: בהתאם לעובי הרקמה, נדרש זמן להתאקלמות הטמפרטורה. הניחו לרקמה לשבת כל עוד נדרש כדי לחתוך בצורה נקייה. התאם OT ו-CT כדי לסייע בהתאקלמות טמפרטורת הרקמות.
- קרב לאט את הרקמה ללהב. לאחר שהרקמה הגיעה ללהב, התחל בתהליך החיתוך. יש להגדיר את עובי החיתוך ל-30 מיקרומטר.
- חתוך פי 2-3 עד ששכבות קליפת המוח נראות לעין.
- הנח ויישר את הצלחת נגד גלגול ממש מעל להב הקריוסטט.
הערה: קו כסף יופיע מהאור בקריוסטט בממשק הלהב והצלחת נגד גלגול. זה מצביע על כך שהצלחת נגד גלגול נמצאת ישירות מעל קצה הלהב.
- התחל לחתוך את החלקים ב -14 מיקרומטר. קטעים חתוכים כראוי יהיו שטוחים מתחת לצלחת נגד גלגול.
הערה: אם הטישו תקוע, ודא שהצלחת נגד גלגול קרה מספיק. במידת הצורך, הנחת חתיכת קרח יבש מבחוץ (הצד שאינו נוגע ב-stagה) תקרר במהירות את הצלחת נגד גלגול.
- חותכים 4-6 חלקים ומיישרים אותם אופקית על פני שלב הקריוסטט.
- זווית השקופית, הרם את כל חלקי הרקמה בבת אחת.
הערה: בעזרת המברשות, הרם את קצות הטישו כדי להפוך אותם לזמינים יותר לשקופית בעת ההרמה. אל תרים קטע אחד בכל פעם. חשיפה לאוויר בטמפרטורת החדר תפגע בשלמות ה-RNA.
זהירות: אל תתנו לממברנה לגעת בשלב הקריוסטט. אם הממברנה נוגעת בשלבמה, היא תתחיל להתנתק ממגלשת הזכוכית ותגרום לשגיאות בעת ניסיון LCM.
- עבור מיד לשלב 6. אל תעכב את הקיבוע.
2. תיקון רקמות/הדמיה ללא כתמים
- לעבור מיד לפרוטוקול קיבוע האתנול
- הנח את השקופית במחזיק השקופיות עם 70% אתנול למשך 2 דקות - על קרח.
- הנח את השקופית במחזיק השקופיות עם 95% אתנול למשך 45 שניות - על קרח.
- הנח את השקופית במחזיק השקופיות עם 100% אתנול למשך 2 דקות - ב-RT.
- טבלו את השקופית 3 פעמים במחזיק השקופית עם קסילן 1 — ב-RT.
- הנח את השקופית במחזיק השקופיות עם קסילן 2 למשך 5 דקות - ב-RT.
- יש להניח לייבוש באזור נקי למשך 30 דקות לפחות. זמני ייבוש ארוכים יותר, עד 60 דקות, הם אופטימליים.
זהירות: השתמש במגלשות עומדות לייבוש בקולט אדים. קסילן הוא נדיף. הנחת מגלשות שטוחות תגרום לקסילן להצטבר בחלק הרקמה, מה שהופך את הרקמה לכהה מדי.
3. הפשרת שקופיות מאוחסנות לשימוש
- הסר את הצינור עם שקופית אחת מהמקפיא -80 מעלות צלזיוס שעה לפני השימוש המיועד.
- אל תפתח מיד את הצינור. אפשר לצינור להגיע לטמפרטורת החדר. עיבוי יתרחש בחלק החיצוני של הצינור בלבד.
- לאחר שהצינור הגיע לטמפרטורת החדר וכל העיבוי נעלם (כ-30-40 דקות), הסר את המכסה וחשוף את השקופית לאוויר בטמפרטורת החדר.
- הניחו לשקופית להתאקלם לטמפרטורת החדר למשך 15-20 דקות. לאחר מכן, השאירו אותו בתוך הצינור כשהמכסה הוסר.
הערה: השקופית מוכנה כעת ל- LCM.
4. לכידת לייזר מיקרו-דיסקציה של תאי פורקינג'ה:
הערה: סעיף פרוטוקול זה ידון רק בפרטים הקשורים ללכידת תאי פורקינג'ה לריצוף RNA עוקב. סעיף זה מניח שהמשתמש מכיר את מיקרוסקופ לכידת הלייזר UV ואת התוכנה הנלווית.
- נקה את שלב המיקרוסקופ ואת זרוע איסוף הכובע עם מטהר RNase.
- בידיים עטויות כפפות, הניחו את השקופית על המיקרוסקופ ומכסה אטום של 500 מיקרוליטר בזרוע האיסוף.
הערה: ודא תמיד טכניקת RNA נכונה על ידי ניקוי אזור העבודה עם מטהר RNase ושימוש בידיים עטויות כפפות תוך נגיעה בשקופית או במכסה האטום. ניתן להסיר כפפות לאחר שהמגלשה והכובע נמצאים במקומם ולכידת הלייזר החלה.
- בהגדלה נמוכה, יישר את הכובע האטום מעל רקמת המוח הקטן, וודא שהכובע מכסה את כל האזור המוצג בעינית.
הערה: רק עינית המיקרוסקופ תראה אם המכסה האטום ממורכז. המצלמה לא תראה אם הכובע מרוכז מעל הרקמה. בהתאם לעיצוב היקף לכידת הלייזר, ההדמיה דרך הכובע האטום תהיה בעינית בלבד או תוצג הן בעינית והן במצלמה.
- דמיין את שכבות המוח הקטן עם עדשת אובייקטיבית פי 5 - 10x והנח את הסמן מעל הקטע שבו השכבה המולקולרית ושכבת תאי הגרגיר מצטלבות (שכבת התא פורקינג'ה).
- עבור ל-40X ודמיין תאי פורקינג'ה.
הערה: ראה איור 1 ו- איור 2 לדוגמה הדמיות.
- התחל ללכוד תאי פורקינג'ה.
הערה: נדרשים לפחות 5 ננוגרם של RNA כדי לבצע ריצוף RNA. כ-1600-2000 תאי פורקינג'ה מניבים מספיק חומר RNA לריצוף. RNA יהיה יציב עד 8 שעות במיקרוסקופ. בדוק את אנרגיית ה-UV ואת מיקוד ה-UV לפני האיסוף כדי לוודא שהרמות נכונות. עם הזמן, הרקמה תמשיך להתייבש, וייתכן שיהיה צורך לשנות את אנרגיית ה-UV ומיקוד ה-UV.
