$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.
1. אחסון מוחות
- הסר במהירות את המוחות מעכברי בר CD1 בוגרים במשקל של כ-30 גרם בגישה קונבנציונלית והקפיא בזק למשך 60 שניות בחנקן נוזלי או איזופנטן מקורר מראש בקרח יבש.
- אחסן מוחות קפואים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס בנייר אלומיניום או בצינורות חרוטיים עד לשימוש.
2. הכנת מטריצת המוח
- עשרים וארבע שעות לפני כריתת רקמות, הניחו מטריצת מוח נקייה על ערימה של אריזות מקפיא מופשרות. סנדוויץ' את דפנות המטריצה בין שתי אריזות מקפיא והקפידו להשאיר כ-0.5 ס"מ בין החלק התחתון של חריצי סכיני הגילוח לחלק העליון של חבילות הג'ל ( איור 1A). מניחים נייר אלומיניום בקצוות כדי לסייע בקירור.
הערה: כשאתם רוכשים מטריצת מוח, קנו מטריצה גדולה מספיק כדי לעטוף את כל נפח המוח לניתוח.
- הניחו את הקופסה המכילה את מטריצת המוח ואריזות המקפיא במקפיא של -20 מעלות צלזיוס כשהחלק העליון פתוח למשך הלילה.
3. הקמת צלחת זכוכית קפואה
הערה: מטרת המערך הזה היא להכין משטח קפוא שעליו ניתן לנתח חלקי מוח.
- מניחים קרח בקופסה מבודדת עד כ-5 ס"מ מלמעלה. לאחר מכן הניחו שכבה של 2.5 ס"מ של קרח יבש על גבי הקרח וכסו ביריעות פלסטיק שחורות כדי לסייע בהדמיה של הדגימה (איור 1B, איור 1C).
- הניחו צלחת זכוכית (אמורה להתאים רק לפתח הקופסה) על גבי הפלסטיק והניחו קרח יבש על גבי הצלחת בפינות הרחוקות (איור 1C).
- קחו את מטריצת המוח הקפואה מהמקפיא והכניסו את המוח כדי לחתוך אותו כלפי מעלה. הניחו לו להתייצב לטמפרטורה בקופסה למשך 10 דקות. שמור את המכסה על הקופסה במהלך תקופה זו.
- התאימו את מיקום המוח במטריצה באמצעות מלקחיים קרים כך שהסינוס הסגיטלי והסינוס הרוחבי יתייצבו עם החריצים הניצבים של הבלוק (איור 1D). זה יעזור להבטיח חתכים סימטריים לדיסקציה קלה יותר. געו בקצות המלקחיים כדי לייבש קרח לזמן קצר כדי לצנן לפני התאמת המוח.
- ברגע שהמוח נמצא במקומו, הניחו סכין גילוח מקורר ליד מרכזו ולחצו את הלהב כ-1 מ"מ לתוך הרקמה. הוסיפו להבים מקוררים לקצוות הרוסטרליים והזנביים כדי לסייע להחזיק את המוח במקומו (איור 2A ו-איור 2B).
- החל מהקצה הרוסטרלי, הוסיפו להבים אחד בכל פעם, הניחו אותם בחריצים ולחצו אותם בעדינות כלפי מטה לתוך הרקמה כ-1 מ"מ (איור 2B). המשך להוסיף להבים במרווחים של 1 מ"מ הפועלים לכיוון הקצה הזנבי.
- ודאו שהמוח לא זז במהלך הזמן הזה. יישר את הלהבים אופקית ואנכית ( איור 2B). ניתן להשתמש בלהבי מיקרוטום בעלי פרופיל נמוך לחיתוך קטעים לרוחב של 0.5 מ"מ. הנח אותם בין סכיני הגילוח הגדולים יותר (איור 2C).
- ברגע שהלהבים נמצאים במקומם, לחצו כלפי מטה על גבי הקבוצה עם האצבעות, כף היד או משטח שטוח אחר ( איור 2C, איור 2D). נדנד את קבוצת הלהבים לאט מצד לצד כדי להעביר אותם דרך הרקמה.
הערה: זה עשוי לקחת קצת זמן (1-2 דקות) ודורש סבלנות. צריכה להיות התנגדות ללהבים הנעים דרך הרקמה. כניסה קלה פירושה שהמוח מפשיר ויש לקרר את הבלוק בקרח יבש.
- כאשר כל הלהבים הגיעו לתחתית החריצים, אחוז בכל צד של קבוצת הלהבים והתנדנד קדימה ואחורה כדי לעבוד ללא המטריצה.
הערה: יש לנקוט משנה זהירות כדי להימנע מחתך בקצוות החדים של הלהבים.
- ברגע שהקבוצה חופשית, הניחו את הערימה, עם הצד הרוסטרלי כלפי מעלה, על לוח הזכוכית (איור 2E). הניחו קרח יבש ליד ו/או מעל הערימה כדי להקפיא עוד יותר את הדגימות להפרדה קלה יותר.
- הנח את הערימה עם קצוות חדים כלפי מטה על צלחת הזכוכית והפרד את הלהבים על ידי הזזת הערימה בין האגודלים והאצבעות. הלהבים צריכים להיפרד זה מזה עם חלקים מחוברים.
- יישר קטעים על לוח הזכוכית מרוסטרל לזנב (איור 2F).
- הפרידו רקמות מהלהבים על ידי כיפוף הלהבים בין האצבעות, או על ידי הפרדה עם סכין גילוח קר שני (איורים 2G, 2H, 2I).
4. ניתוח קטעים
- פתח את אטלס המוח של עכבר אלן או התייחסות אחרת ומצא ציוני דרך הדרושים לזיהוי אזורי עניין. כמה ציוני דרך ברורים כוללים את הקומיסורה הקדמית, הקורפוס קלוסום, החדרים הצדדיים וההיפוקמפוס (איור 3).
- הפוך את החלק שיש לחתוך עם מלקחיים צוננים וודא שהאזור שעומד להיאסף עקבי לאורך כל הדרך. במהלך הקטיף, עיין באטלס הייחוס לעתים קרובות כדי להבטיח את החזר ההשקעה הנכון.
הערה: זכוכית מגדלת או מיקרוסקופ מנתח מועילים לעתים קרובות בתהליך זה. תאורה טובה היא גם חיונית. מנורות לד בהספק נמוך או מנורה מגניבה יכולות לשמש למטרה זו.
- בעזרת אזמל נקי או אגרוף, חתכו לתוך הקטע ( איור 4). צננו כל כלי לפני החיתוך על ידי נגיעה קצרה בו לקרח יבש. דחף את הלהב בעדינות אך בחוזקה לתוך הרקמה, נדנד אותו קדימה ואחורה כדי לבצע את החיתוך. אל תלחץ חזק מדי או שהרקמה תישבר.
הערה: הכלים יתחממו עם הזמן. להבים מחוממים מעט יכולים לעזור לבצע חתכים נקיים ולהגביל את השבירה, אך היזהר להימנע מהפשרת רקמות. מעת לעת מצננים כלים על קרח יבש.
- לאחר קציר החזר ROI, הנח אותו בצינורות מסומנים ומקוררים מראש של 1.5 מ"ל. יש לאחסן טישו שנקטף בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד הצורך.
